李 敏

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科 鄭州 450014

毛細(xì)管電泳（CE）技術(shù)以快速、高效、高靈敏度、重復(fù)性好、易定量、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及便于自動(dòng)化等特點(diǎn)［1］，已廣泛應(yīng)用于生物分子的分離和測(cè)定。脫氧核糖核酸（DNA）分子便是毛細(xì)管電泳技術(shù)在生物分子領(lǐng)域的應(yīng)用重點(diǎn)之一。CE技術(shù)由于解決了電泳過程中焦耳熱的散失問題，可以使用高電壓，且可以在線檢測(cè)，大大提高了分析效率。而且近年來激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)（LIF）的使用也很大程度上提高了分辨率［2］，因而在DNA序列分析和基因突變分析中CE技術(shù)已經(jīng)占據(jù)重要位置［3］。一般采用平板電泳及高效液相色譜（HPLC）來評(píng)價(jià)產(chǎn)品，但這兩種方法耗時(shí)比較長，且因?yàn)槿旧踔练派湫詷?biāo)記（平板電泳法），樣品需求量大（HPLC法）等因素給分析者帶來不便，而利用毛細(xì)管電泳能很好地滿足少量反義寡核苷酸的測(cè)定。

反義核酸技術(shù)是用人工合成的或生物合成的特定互補(bǔ)的DNA或RNA片段阻斷從基因到蛋白的信息流，以達(dá)到抑制或阻斷基因表達(dá)的生物新技術(shù)［4］。反義寡核苷酸類藥物是通過這一機(jī)制在基因水平進(jìn)行調(diào)控的分子藥物。該類藥物是藥理學(xué)的新領(lǐng)域，作為潛在的治療方法，在各種疾病的治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。多種針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的反義核酸研究正在蓬勃開展。在合成這一類反義寡核苷酸中，常常需要對(duì)合成產(chǎn)物的長度、純度等進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，避免影響進(jìn)一步的活性實(shí)驗(yàn)及使用效果。本工作通過試圖建立一種用于DNA產(chǎn)品的定量定性檢測(cè)，快速靈敏地測(cè)得反義寡聚核苷酸的含量［5］。

1 材料與儀器

P／ACE5000毛細(xì)管電泳儀（美國Beckman公司）；DAD檢測(cè)器（美國Beckman公司）；石英毛細(xì)管柱，內(nèi)徑75μm，外徑375μm，長度50cm（進(jìn)樣端至檢測(cè)窗口的有效長度37 cm，河北永年光導(dǎo)纖維廠）；三羥甲基氨基丙烷（Tris，USB公司）；硼酸（分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA，上?；瘜W(xué)試劑公司）；丙烯酰胺（鄭州康橋?qū)嶒?yàn)產(chǎn)品有限公司，進(jìn)口分裝）；過硫酸銨（分析純，北京化工廠）；甲基丙烯基甲氧基硅烷（KH－570，分析，純南京曙光化工廠）；丙烯酰胺（N，N，N′，N′－四甲基乙二胺，TEMED，分析純，上海前進(jìn)試劑廠）。

2 方法

2.1方法學(xué)研究反義寡聚核苷酸在6.25～100.0μg／mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y＝9 281.3C－4 159.0，r＝0.9950（n＝5），反義寡聚核苷酸的最低檢測(cè)限為1.0μg／mL。

2.2 pH值的選擇于50mmol／L TRIS（3.025g）中加入50mmol／L（1.546g）硼酸溶液，再加入2mmol／L的EDTA（0.372g），配制成50mmol／L TBE緩沖液溶液，此時(shí)的pH值為8.5，用0.22μm濾膜過濾。調(diào)系列TBE緩沖溶液至pH 分別為8.5、8.3、8.0、7.8、7.5、7.2、7.0。在pH 7.2時(shí)，聚賴氨酸與反義寡聚核苷酸縮合體最穩(wěn)定，分離選擇性最好。

2.3進(jìn)樣方式的選擇毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式一般有兩種，即電動(dòng)進(jìn)樣和壓力進(jìn)樣兩種［6］。如果采用電壓方式，分別在電壓為5、10、15、20、25kV時(shí)，都不能得到目標(biāo)峰，而采用壓力進(jìn)樣方式時(shí)，在5、10、15、20psi時(shí)，均能出峰，且在10 psi時(shí)，出峰結(jié)果最佳。

2.4電泳條件毛細(xì)管在每次使用前，先用0.1mol／L氫氧化鈉溶液在20psi條件下沖洗10min，接著用水沖洗毛細(xì)管5min，再用緩沖液沖洗毛細(xì)管5min。2次進(jìn)樣之間以緩沖液沖洗2min。采用壓力法進(jìn)樣，條件是：10psi，5s，選擇柱溫25℃，分離電壓10kV，檢測(cè)波長260nm。電泳緩沖液50mmol／L TBE緩沖液（pH 為7.2）［7－8］。

2.5柱溫和電壓對(duì)分離的影響研究表明，柱溫降低分離度變好，但柱效減低，分析時(shí)間變長。分離電壓是毛細(xì)管電泳的一項(xiàng)重要參數(shù)。實(shí)驗(yàn)表明，增加組分的遷移速度是減少譜帶展寬、提高分離效率的重要途徑，增加電場(chǎng)強(qiáng)度可以達(dá)到提高速度的目的［9］。但高場(chǎng)強(qiáng)導(dǎo)致通過毛細(xì)管的電流增加，從而增大焦耳熱（自熱），同時(shí)高溫會(huì)使聚賴氨酸與反義寡聚核苷酸縮合體解壓縮，因此選10kV較合適。

2.6毛細(xì)管柱改性取一段石英毛細(xì)管（約50cm×75 μm），分別用1mol／L NaOH沖洗30min，H2O沖洗30min，接著用1mol／L HCl沖洗30min，H2O各沖洗30min，然后通氮?dú)飧稍?0min。取甲基丙烯基甲氧基硅烷20μL加到5 mL水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.5。加壓使甲基丙烯基甲氧基硅烷溶液通入毛細(xì)管內(nèi)，流出約5滴，減壓后室溫反應(yīng)12 h。再用氮?dú)饧訅簤撼雒?xì)管內(nèi)剩余液體，爾后用甲醇沖洗20min，水沖洗20min。將0.422mol／L丙烯酰胺溶液（5 mL）超聲脫氣30min，加入5μL的TEMED和50μL過硫酸銨（0.438mol／L）?；旌虾罅⒓磳⒈０啡芤簤喝朊?xì)管內(nèi)，加壓10min后，減壓室溫反應(yīng)12h，用水沖洗40min，氮?dú)鉀_洗干燥30min，放入37℃烘箱中活化1h［10］。

2.7數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理由Beckman公司所配的Gold軟件處理系統(tǒng)完成。

3 結(jié)果

3.1緩沖溶液對(duì)分離的影響分別用TA緩沖液和TBE緩沖液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果在260nm處，10kV分離60min，使用TA緩沖液沒有出峰（圖1所示），說明TA緩沖液不適合反義寡聚核苷酸的分離。換用50mmol／L TBE緩沖液對(duì)反義寡聚核苷酸進(jìn)行分離，選擇性良好（圖2所示）。

圖1 TA作為緩沖液時(shí)的色譜圖

圖2 TBE作為緩沖液時(shí)的色譜圖

3.2 pH值對(duì)分離的影響對(duì)不同pH值緩沖溶液的研究結(jié)果顯示，pH 7.0時(shí)不出峰（見圖3），pH 7.2時(shí)出峰情況較理想（見圖4）。在pH 7.2時(shí)，聚賴氨酸與反義寡聚核苷酸縮合體最穩(wěn)定，分離選擇性最好。

圖3 緩沖液pH7.0時(shí)的色譜圖

圖4 緩沖液pH7.2時(shí)的色譜圖

3.3柱溫和電壓對(duì)分離的影響研究表明，柱溫降低分離度變好，但柱效減低，分析時(shí)間變長（如圖5所示）。綜合考慮分離度和遷移行為的變化，溫度在25℃ 時(shí)，出峰情況較理想，本實(shí)驗(yàn)選用25℃柱溫較合適（如圖6所示）。

圖5 溫度15℃時(shí)的色譜圖

圖6 溫度25℃時(shí)的色譜圖

3.4進(jìn)樣方式對(duì)結(jié)果的影響

圖7 電動(dòng)進(jìn)樣時(shí)的色譜圖

圖8 壓力進(jìn)樣時(shí)的色譜圖

圖9 反向進(jìn)樣時(shí)的色譜圖

圖10 正向進(jìn)樣時(shí)的色譜圖

從以上色譜圖可以看出，采用正向壓力進(jìn)樣方式適合該樣品的分析。

3.5實(shí)驗(yàn)條件的確定從以上各個(gè)條件的優(yōu)化可以看出，在壓力為10psi，正向電壓進(jìn)樣，溫度為25℃的進(jìn)樣條件下，進(jìn)樣5s，10kV分離電壓條件下，樣品可以得到很好分離。色譜圖見圖11、12。在該條件下，縮和體中的游離DNA和縮和體本身能良好分離。

圖11 對(duì)照品的色譜圖

圖12 縮和體中游離DNA色譜圖

3.6毛細(xì)管柱的改性因?yàn)閮?nèi)壁石英分子除能造成電滲流外，還會(huì)吸附溶質(zhì)中帶正電荷的分子，從而影響分離效果。為避免分析物被管壁吸附，對(duì)毛細(xì)管柱進(jìn)行改性，如圖13、14所示。涂層后丙酮基本不出峰，可見柱子的改性基本成功。

圖13 涂層前毛細(xì)管柱用丙酮進(jìn)樣色譜圖

圖14 涂層后毛細(xì)管柱用丙酮進(jìn)樣色譜圖

4 討論

4.1緩沖溶液對(duì)分離的影響經(jīng)過對(duì)不同緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)用TA緩沖液時(shí)，結(jié)果在260nm處，10kV分離60min發(fā)現(xiàn)沒有出鋒，而換用50mmol／L的TBE緩沖液對(duì)反義寡聚核苷酸進(jìn)行分離時(shí)，峰形良好。原因可能是EDTA的絡(luò)合作用，使毛細(xì)管中少量殘存的離子被絡(luò)合，峰形更好。

4.2 pH值對(duì)分離的影響pH值對(duì)分離具有很重要的影響。不同的pH值緩沖溶液的研究結(jié)果表明，在pH 7.2～8.0時(shí)，均有良好峰形。但反義寡聚核苷酸縮合體在pH高于7.2時(shí)，縮合體開始不穩(wěn)定。結(jié)果選擇在pH 7.2時(shí)，聚賴氨酸與反義寡聚核苷酸縮合體最穩(wěn)定，分離選擇性最好。

4.3柱溫和電壓對(duì)分離的影響實(shí)驗(yàn)研究表明，柱溫降低分離度變好，但柱效減低，分析時(shí)間變長。分離電壓是毛細(xì)管電泳的一項(xiàng)重要參數(shù)。在高電壓作用下，雙電層水合陽離子層引起整個(gè)溶液在毛細(xì)管中向負(fù)極方向移動(dòng)，形成電滲流。實(shí)驗(yàn)表明，增加組分的遷移速度是減少譜帶展寬、提高分離效率的重要途徑，增加電場(chǎng)強(qiáng)度可達(dá)到提高速度的目的。但高場(chǎng)強(qiáng)導(dǎo)致通過毛細(xì)管的電流增加，從而增大焦耳熱（自熱），同時(shí)高溫會(huì)使聚賴氨酸與反義寡聚核苷酸縮合體解壓縮，因此，選10kV較合適。

4.4進(jìn)樣方式對(duì)結(jié)果的影響實(shí)驗(yàn)研究表明，帶電粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)溶液中的遷移速度等于電泳和電滲流二者的矢量和，因此，陽離子首先從負(fù)極流出；中性離子的速度等于電滲流速度，隨后流出；而由于電滲流速度大于電泳速度，因此，陰離子最后流出。本實(shí)驗(yàn)測(cè)的是陽離子物質(zhì)，只有用正向進(jìn)樣反向分離的方式才最適合本物質(zhì)的分離。

4.5毛細(xì)管柱的改性因?yàn)閮?nèi)壁石英分子除能造成電滲流外，還會(huì)吸附溶質(zhì)中帶正電荷的分子，從而影響分離效果。為了避免分析物被管壁吸附，對(duì)毛細(xì)管柱進(jìn)行改性。結(jié)果顯示改性后的毛細(xì)管柱對(duì)丙酮的敏感性明顯降低，幾乎不出峰。

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