張 焱，余 勇，吳立成

(1．金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 金華 321017；2．金華市食品藥品檢驗(yàn)所，浙江 金華 321000)

·基礎(chǔ)與臨床研究·

二苯乙烯苷對C57BL/6J小鼠毛發(fā)生長影響的研究

張 焱1，余 勇1，吳立成2

(1．金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 金華 321017；2．金華市食品藥品檢驗(yàn)所，浙江 金華 321000)

目的：探討二苯乙烯苷對小鼠毛囊毛發(fā)生長周期及其小鼠觸須毛囊體外培養(yǎng)的影響。方法將C57BL/6J小鼠分組，采用不同濃度的二苯乙烯苷灌胃以及培養(yǎng)液離體培養(yǎng)小鼠觸須毛囊的方法，在給藥后的不同時(shí)間觀察各組小鼠毛發(fā)生長狀況。結(jié)果二苯乙烯苷灌胃組中，50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組較對照組明顯誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠毛發(fā)生長，縮短小鼠皮膚變黑時(shí)間，早期加速小鼠毛發(fā)的生長速度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且100μg/ml組作用更明顯(P<0.01)。二苯乙烯苷離體培養(yǎng)小鼠觸須毛囊組中， 0.1mg/L、0.3mg/L組培養(yǎng)第8天毛囊毛發(fā)生長長度大于對照組和其他實(shí)驗(yàn)組。結(jié)論二苯乙烯苷具有明顯的促進(jìn)毛發(fā)生長作用。

C57BL/6J小鼠；毛發(fā)生長周期；二苯乙烯苷；毛囊體外培養(yǎng)

Abstract:[Objective] To discuss the effect of stilbene to growth cycle of hair and palp’s hair follicle culture in vitro in C57BL/6J mouse.[Method] Stilbene was used in C57BL/6J mouse in different concentration .The mouse were divided into two groups .Group one was practiced with administration by gavage . Group two was used culture solution to culture palp’s hair follicle. The two group’s hair growth situation were observed.[Result] In group one, 50mg/ml,100mg/ml and 150mg/ml stilbene can induce hair growth and shorten skin blacken time obviously . The difference is significant (P<0.05). Among the group, 100ug/ml stilbene’s effect was most obvious (P<0.01). In group two, 0.1mg/L,0.3mg/L stilbene can make hair follicle grow longer than comparison group after 8 day’s culture. [Conclusion] Stilbene can accelerate the growth of hair obviously.

Keywords: C57BL/6J mouse; growth cycle of hair; stilbene; hair follicle culture in vitro

脫發(fā)是臨床常見疾病,脂溢性脫發(fā)、斑禿等脫發(fā)問題一直是臨床治療的難題。何首烏是臨床上治療斑禿的主要中藥之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究已表明，何首烏的主要活性成分二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-0-Beta-D-glucoside，THSG)具有抗衰老、降低膽固醇、提高免疫功能、防止動脈硬化及保護(hù)細(xì)胞等功效[1-2]，但是否對毛發(fā)具有生長作用以及通過何種途徑發(fā)揮作用，國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。我們以動物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，于2011年至2012年與金華市食品藥品檢驗(yàn)所合作研究探討二苯乙烯苷對小鼠毛囊毛發(fā)生長及其小鼠觸須毛囊體外培養(yǎng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6～8周齡的近交系C57BL/6J小鼠由金華市食品藥品檢驗(yàn)所提供，SPF級，雌性，體質(zhì)量20～26g，選擇鼠皮為粉紅色、毛發(fā)處于休止期的小鼠。

1.1.2 二苯乙烯苷 參考戚愛棣[3]研究報(bào)道方法進(jìn)行提取。

1.2 方法

1.2.1 小鼠體內(nèi)灌服實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組：分為7組，每組6只小鼠。將松香與石蠟混合加熱融化涂于小鼠背部，涂抹面積約3cm×4cm，冷卻凝固后揭去，以去除背毛。確認(rèn)休止期(小鼠背部皮膚呈粉紅色)開始給藥。

1.2.1.2 給藥：對照組為陰性組，不灌服二苯乙烯苷；實(shí)驗(yàn)組分別把濃度為1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml的二苯乙烯苷1ml灌入C57BL/6J小鼠體內(nèi)，觀察小鼠皮膚顏色變化和毛發(fā)生長情況。

1.2.1.3 觀察記錄：灌服后每天觀察小鼠皮膚及毛色變化，記錄每只小鼠背部去毛區(qū)的皮膚顏色從服藥到開始變黑的時(shí)間(陰性對照組則記錄小鼠皮膚從粉紅色到開始變黑的時(shí)間)；從開始變黑到長滿毛的時(shí)間以及開始變黑至開始變灰的時(shí)間。給藥后第9天、18天，每組隨機(jī)選擇3只小鼠，處死, 取相同脫毛區(qū)皮膚,做常規(guī)石蠟切片和蘇木素伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察,并與對照組進(jìn)行比較。繼續(xù)觀察余下小鼠皮膚顏色變化和毛發(fā)生長情況。

1.2.2 小鼠觸須毛囊體外實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 小鼠觸須毛囊器官培養(yǎng)的建立：6～8周齡的C57BL/6J小鼠(由金華市食品藥品檢驗(yàn)所提供)，斷頸處死，立即剪去雙側(cè)胡須，用75%乙醇消毒上唇部3遍，無菌條件下剪取雙側(cè)胡須墊，置于D-Hanks液中，反復(fù)沖洗3遍后置于Williams培養(yǎng)液中，在立體解剖顯微鏡下用顯微剪、鑷分離出生長期毛囊，選取完整無損傷的生長早期毛囊減去上1/3部分。毛囊培養(yǎng)在96孔板(Costar公司)中進(jìn)行，每孔僅放一個(gè)毛囊，每孔含Williams無血清培養(yǎng)液0.2ml，然后放進(jìn)37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：分為9組，每組8個(gè)毛囊，對照組Williams培養(yǎng)液中不加二苯乙烯苷。實(shí)驗(yàn)組分8組，在Williams培養(yǎng)液中加入二苯乙烯苷，使二苯乙烯苷的濃度分別為0.001mg/L、0.003mg/L、0.01mg/L、0.03mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、1mg/L、3mg/L。

1.2.2.3 觀察記錄毛發(fā)生長情況：培養(yǎng)的第1天至第8天，經(jīng)倒置顯微鏡下通過目鏡測微器每天測量自毛囊底部至毛發(fā)頂部的長度，將第8天與第1天的測量結(jié)果相減即為毛發(fā)生長長度，比較各組的毛發(fā)生長長度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 皮膚顏色改變

與對照組比較，二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組明顯縮短了小鼠皮膚變黑時(shí)間，皮膚由黑色到長滿毛的時(shí)間間隔也明顯縮短，且100μg/ml組作用更明顯(P<0．01)。對小鼠皮膚變灰時(shí)間, 各組間無顯著差異。結(jié)果見表1。

表1 二苯乙烯苷灌胃對鼠毛發(fā)生長周期的影響

與對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

2.2 毛囊及毛細(xì)血管增長

給藥第9天,二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組較對照組小鼠脫毛區(qū)毛囊較大, 數(shù)量較多，多數(shù)分布在真皮深層，而且真皮層小血管數(shù)量明顯增多(圖2A、2B)。給藥第18天, 對照組小鼠脫毛區(qū)毛囊數(shù)量較少且縮短、扭曲, 真皮層小血管數(shù)量也較少(圖2C)。二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組小鼠脫毛區(qū)毛囊數(shù)量增多明顯, 且毛囊、毛乳頭較大、生長旺盛，真皮層小血管數(shù)量也明顯增多(圖2D)。結(jié)果見表2。

表2 二苯乙烯苷灌胃對鼠脫毛區(qū)皮膚毛囊數(shù)和小血管數(shù)的影響

與對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

A 第9天對照組毛囊較小，位于真皮和皮下組織交界，血管少

2.3 毛發(fā)生長長度

培養(yǎng)第8天各組小鼠毛囊毛發(fā)平均生長長度見表3。二苯乙烯苷0.1mg/L、0.3mg/L組的毛發(fā)生長長度大于對照組，其余各組和對照組之間的毛囊毛發(fā)生長長度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 二苯乙烯苷小鼠觸須毛囊生長的影響

與對照組比較:*P<0.05 ，**P<0.01

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇6～8 周的C57BL/6J小鼠，其所有毛囊已由生長期進(jìn)入靜止期, 生理狀態(tài)下不再自發(fā)進(jìn)入生長期，需經(jīng)人工脫毛或者拔毛等刺激后，誘導(dǎo)其毛發(fā)進(jìn)入生長期, 并可自發(fā)經(jīng)過退行期再進(jìn)入休止期。此周期活動與自然周期相比無明顯差異[4]。小鼠軀干皮膚黑色素細(xì)胞只存在于毛囊中，且僅在生長期時(shí)合成黑色素并傳遞給角質(zhì)形成細(xì)胞使皮膚變?yōu)楹谏?。至退行期，黑色素生成減少，皮膚變成灰色，休止期皮膚再變?yōu)榉奂t色。因此，可以根據(jù)小鼠皮膚顏色來大致判斷其毛發(fā)生長周期情況[5]。

我們采用二苯乙烯苷作為實(shí)驗(yàn)藥物，采用灌胃給藥和小鼠觸須毛囊體外培養(yǎng)的方法，研究二苯乙烯苷對C57BL/6J小鼠毛囊毛發(fā)生長周期的影響。肉眼觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組較對照組小鼠的背部皮膚顏色由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏臅r(shí)間縮短，顯示提前由休止期進(jìn)入生長期(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)人生長期后這幾組小鼠的毛發(fā)生長速度也明顯快于對照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且100μg/ml組作用更明顯(P<0.01)。組織學(xué)檢查結(jié)果與肉眼觀察的皮膚顏色變化一致，二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組能明顯增加皮膚毛囊數(shù)及毛囊毛細(xì)血管數(shù)量，從而營養(yǎng)毛囊, 使毛囊變多、變粗，達(dá)到加快毛發(fā)生長的作用。其余劑量組則與對照組相比無差異。小鼠觸須毛囊體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二苯乙烯苷0.1mg/L、0.3mg/L組的毛發(fā)生長長度大于對照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果表明，適量的二苯乙烯苷無論灌胃還是體外培養(yǎng)均能誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠毛發(fā)生長，促進(jìn)C57BL/6J小鼠毛發(fā)由休止期向生長期轉(zhuǎn)變，明顯縮短小鼠皮膚變黑時(shí)間，能加速小鼠毛發(fā)在生長期早期的生長，但對毛發(fā)生長周期無明顯影響。其作為生發(fā)藥物作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[1]張彩平,楊瀅,田英,等. 二苯乙烯苷對 H2 02 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào),2012,28 (8):1088-1092.

[2]李彩蓉,蔡飛,黎榮,等.二苯乙烯苷對高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞衰老相關(guān)信號的調(diào)節(jié)作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2010,26 (2):272-273.

[3]戚愛棣. 何首烏中二苯乙烯苷提取工藝優(yōu)選及炮制對其含量的影響[J].中草藥,2002,33 (7):609.

[4]Paus R, Handjiski B, Czarnetzki BM, et al. A murine model for inducing and manipulating hair follicle regression ( catagen) : effects of dexamethasone and cyclosporin A [J]. J Invest Dermatol , 1994, 103(2) : 143-147.

[5]Slominski A, Paus R. Melanogenesis is coupled to murine anagen: toward new concepts for the role of melanocytes and the regulation of melanogenesis in hair growth [J]. J Invest Dermatol, 1993, 101( 1 Suppl ) : 90S-97S.

TheeffectofstilbenetogrowthcycleofhairinC57BL/6Jmouse

ZHANGYan1,YUYong1，WULicheng2

(1．Jinhua Polytechnic Medical College，Zhejiang 321017 ，China；2．Jinhua City Food and Drug Inspection Institute,Zhejiang 321000,China)

R758.71

A

1672-0024(2013)02-0038-04

金華市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號：2007-3-060)