寧夏醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（750004）馬啟珍

北京市通州區(qū)藥品檢驗所（101100）馬啟武△

復(fù)方丹參片是由丹參、三七、冰片組成的復(fù)方制劑，具有活血化瘀、理氣止痛功效。其有效成分包含脂溶性的蒽醌類成分和水溶性的酚酸類成分。脂溶性蒽醌類成分包括丹參酮I、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮等10余種成分，統(tǒng)稱為丹參酮，其中以丹參酮ⅡA含量較高；水溶性酚酸類成分包括丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和其他酚酸類成分[1][2][3][4]，水溶性成分可能是丹參治療心血管疾病的主要有效成分之一[5]。筆者對市場上流通的不同廠家生產(chǎn)的10批次復(fù)方丹參片的甲醇提取液的特征圖譜進行確定并對特征峰進行指認。

1 儀器與試藥

日本島津公司LC-20A高效液相色譜儀（SPD-M20A檢測器）； MettLer XS205天平（十萬分之一）；超聲儀[由天津電子新技術(shù)（北京）有限公司提供]；丹參酮ⅡA對照品（批號：110766-200619）、隱丹參酮（批號：110852-2000305）、丹參酮Ⅰ（批號：0867-200205），均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇（色譜純），純化水，其他試劑均為分析純。

2 實驗方法[6]

附圖1 丹參酮ⅡA對照品

附圖2 復(fù)方丹參片樣品

附圖3 陰性對照品

2.1 色譜條件 色譜柱：WondaSiL C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（73∶27）；檢測波長：270nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃，理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA色譜峰計不低于2000。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品10.25mg加入到100mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為儲備液。取儲備液4mL加入到10mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（40μg/mL）。進樣量10μL。

2.3 供試品溶液制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取約1g，精密稱定，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）15min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液置棕色瓶中，即得。進樣量10μL。

2.4 陰性對照品溶液的制備按處方比例，稱取除丹參的其余飲片，按藥典工藝制成顆粒，依上法制成陰性對照品溶液。進樣量10μL。

3 方法學(xué)考查

3.1 干擾性試驗 取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液依法進樣，測定。供試品在與對照品相同的保留時間處有相同色譜峰，而陰性對照品沒有出現(xiàn)，無干擾，見附圖1～3。

3.2 線性范圍考察 取丹參酮ⅡA 對照品儲備液，精密量取2mL、4mL、6mL、8mL，分別加入到10mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成20.5μg/mL、41.0μg/mL、61.5μg/mL、82.0μg/mL、102.5μg/mL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述色譜條件分別進樣測定，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（Y）為縱坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積（X）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為Y＝aX+b，a＝8.6054×10-7，b＝0.0556，R＝0.99999。本次實驗結(jié)果表明丹參酮ⅡA在20.5～102.5μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 精密度和溶液的穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液，連續(xù)進樣5次，每次10μL，以色譜峰面積計算，測定結(jié)果的丹參酮ⅡA的RSD為0.06%，表明精密度良好。取對照品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進樣，每次10μL，共進樣6次，測定峰面積，測定結(jié)果的RSD為0.05%，表明丹參酮ⅡA溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗 取同一批樣品內(nèi)容物5份，按照供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，測定結(jié)果丹參酮ⅡA的RSD為1.09%，重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收試驗 分別稱取6份同一樣品約0.9g（批號：100615），分別精密加入對照品溶液25mL（精密稱取丹參酮ⅡA8.09mg，精密加甲醇200mL，搖勻），按供試品溶液制備方法操作。照上述色譜條件，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果良好，見附表1。

4 特征圖譜的確定及特征峰的指認[7][8][9][10]

4.1 特征峰的指認 按上述色譜條件的方法，取10批樣品內(nèi)容物各1份，照供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見附圖4。根據(jù)10批樣品共有峰的情況比較，確定了4個特征峰，用對照品指認了其中的峰2、峰3、峰S分別為隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA。

4.2 特征圖譜測定條件的考察

4.2.1 不同色譜柱的考察 分別用KromSiL、DiamonSiL、WondaSiL 三個品牌（規(guī)格同為C185μm，150mm×4.6mm）的色譜柱進行了比較，結(jié)果表明各色譜柱出峰順序基本一致，各個色譜柱對各1～4（S）色譜峰分離效果均較好，但其他色譜峰分離度及保留時間均差異較大，故僅確定上述4個峰作為特征峰進行分析。計算特征峰相對保留時間的相對偏差，結(jié)果顯示，特征峰1～4（S）RSD均小于3%，結(jié)果見附表2，故上述3 個品牌的150mm色譜柱均可用于特征圖譜的測定。

附圖 4 10批復(fù)方丹參片色譜圖

附表1 加樣回收試驗

附表2 不同色譜柱相對保留時間

附表3 不同柱溫條件下特征峰的相對保留時間

附表4 10批復(fù)方丹參片特征圖譜共有峰相對保留時間

4.2.2 不同柱溫的考察 分別采用不同的柱溫進行了比較，結(jié)果表明不同溫度條件下出峰順序基本一致，對1～4（S）色譜峰分離效果均較好。計算特征峰相對保留時間的相對偏差，結(jié)果顯示，特征峰1～4（S）RSD均小于2%，故25℃～35℃可用于特征圖譜的測定。結(jié)果見附表3。

4.3 樣品的測定 按上述色譜條件的方法，測定10批樣品共有峰保留時間，并以丹參酮ⅡA（S）為參照峰，計算各峰的相對保留時間。結(jié)果見附表4。結(jié)果顯示，不同批號樣品之間共有峰相對保留時間RSD均小于1%。

4.4 各特征峰相對保留時間規(guī)定值的確定 綜合上述不同條件下，以丹參酮ⅡA為參照峰，計算得到的相對保留時間，求取平均值作為規(guī)定值，分別為0.44（峰1）、0.60（峰2）、0.70（峰3），并且相對保留時間，均應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍內(nèi)。

5 討論

復(fù)方丹參片作為傳統(tǒng)中藥制劑，充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點的特點，因此對其含有各個成分也應(yīng)有相應(yīng)的質(zhì)量控制。特征圖譜及特征峰作為藥品特別是中藥的質(zhì)量控制方法，操作簡單，適用性強，可以用于定性和定量檢測。