汪麗燕 李 濱 鄭清華

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科1(534001) 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科2

Periostin又稱成骨細(xì)胞特異性因子2(osteoblast-specific factor-2，OSF-2)，是一種由二硫鍵連接而成的基質(zhì)特異性細(xì)胞黏附分子，屬于成束蛋白(fasciclin)家族成員，在骨和牙的形成、維持以及心臟發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。臨床研究證據(jù)顯示periostin參與了多種惡性腫瘤，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌等的發(fā)生、發(fā)展［1］。胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，晚期胃癌患者預(yù)后不良，術(shù)后復(fù)發(fā)和死亡率高。腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生是腫瘤化療失敗的主要原因之一，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和死亡，因此研究胃癌耐藥性的產(chǎn)生機制對提高化療效果具有重要意義。Li等［2］發(fā)現(xiàn)periostin mRNA和蛋白低表達于正常胃黏膜和良性胃黏膜病變組織，在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中則呈過表達，且其表達增高與腫瘤分期有相關(guān)趨勢，提示periostin在胃癌進展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。新近劉宇［3］的研究顯示，胃癌患者periostin蛋白血清濃度和癌組織表達均顯著增高，尤其是有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤較深者;除參與胃癌細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，periostin過表達還能降低胃癌細(xì)胞對化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性，但periostin參與胃癌化療耐藥性的機制尚未闡明。與既往研究結(jié)果不同，本課題組前期研究［4］通過構(gòu)建表達人periostin全長序列的重組質(zhì)粒并以之穩(wěn)定轉(zhuǎn)染periostin基因低表達的人胃癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)過表達periostin基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞的增殖能力并無明顯影響。本研究應(yīng)用前期研究構(gòu)建的重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株，通過檢測經(jīng)化療藥物順鉑(cisplatin)或5-Fu處理的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡情況以及凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素c、caspase-3、多聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PARP］表達，明確periostin基因過表達對順鉑和5-Fu誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的影響及其可能機制。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑、儀器

人胃癌細(xì)胞株SGC7901(American Type Culture Collection)，表達人periostin全長序列的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-periostin(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科構(gòu)建、保存［4］)，Akt特異性抑制劑 MK-2206(Selleck Chemicals)，順鉑、5-Fu(Sigma-Aldrich Co.)，BD PharmingenTMAnnexin V∶FITC 凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences)，小鼠抗人細(xì)胞色素c單克隆抗體、小鼠抗人 β-actin單克隆抗體、小鼠 IgGHRP、兔 IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)，兔抗人 cleaved caspase-3單克隆抗體、兔抗人cleaved PARP單克隆抗體(Cell Signaling Technology，Inc.)，Amersham ECL Plus蛋白質(zhì)印跡法檢測試劑(Life Sciences，GE Healthcare)。流式細(xì)胞儀(Bio-Rad Laboratories，Inc.)，全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):SGC7901細(xì)胞使用RPMI1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-periostin重組質(zhì)粒和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的SGC7901細(xì)胞株的構(gòu)建步驟參照本課題組前期研究［4］。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染periostin和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株以及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞株按2×104/孔接種于96孔板，以 MK-2206(1 μmol/L)預(yù)處理30 min后，加入不同濃度順鉑(0、1、3、5 μmol/L)或 5-Fu(0、1、5、10 μmol/L)處理24 h。收集各組細(xì)胞，按凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，染色完畢后立即上流式細(xì)胞儀檢測。Annexin V染色陽性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，PI染色陽性細(xì)胞為壞死細(xì)胞，Annexin V和PI染色雙陽性細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，Annexin V和PI染色雙陰性細(xì)胞為正?；罴?xì)胞。

4.蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達:將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染periostin和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株以及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞株按5×105/孔接種于12孔板，以 MK-2206(1 μmol/L)預(yù)處理30 min 后，加入5 μmol/L順鉑或10 μmol/L 5-Fu處理24 h，同時設(shè)置不予轉(zhuǎn)染、亦不予順鉑或5-Fu處理的空白對照組。細(xì)胞密度達到70% ～80%時收集各組細(xì)胞，提取蛋白，BCA法蛋白定量。取50 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗孵育，ECL顯影、定影，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描、分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、Periostin基因過表達抑制順鉑、5-Fu誘導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞分析顯示，順鉑和5-Fu處理24 h均可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡，作用呈劑量依賴性(P＜0.05)。與空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組相比，periostin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組 SGC7901細(xì)胞對順鉑和5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著抗性(P＜0.05)，5 μmol/L順鉑和 10 μmol/L 5-Fu 分別可誘導(dǎo)約14%和約10%的空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)生凋亡，但僅分別可誘導(dǎo)約8%和約6%的periostin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)生凋亡(見圖1)，表明periostin基因過表達可抑制順鉑、5-Fu誘導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞凋亡。

圖1 各組SGC7901細(xì)胞順鉑或5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率比較(流式細(xì)胞分析)

二、Periostin基因過表達抑制SGC7901細(xì)胞的線粒體依賴性凋亡途徑

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，不予轉(zhuǎn)染、不予順鉑或5-Fu處理的空白對照組SGC7901細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)胞色素c、cleaved caspase-3、cleaved PARP 蛋白表達微弱。順鉑和5-Fu處理24 h均可促進SGC7901細(xì)胞的細(xì)胞色素c由線粒體釋放至胞質(zhì)，同時caspase-3激活，PARP剪切增強。與空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組相比，periostin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞的胞質(zhì)細(xì)胞色素 c、cleaved caspase-3、cleaved PARP 蛋白表達均明顯下調(diào)(見圖2)，表明periostin基因過表達可逆轉(zhuǎn)順鉑、5-Fu誘導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素c釋放以及caspase-3活化，系通過抑制線粒體依賴性凋亡途徑抑制SGC7901細(xì)胞凋亡。

圖2 各組SGC7901細(xì)胞順鉑或5-Fu誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白表達比較(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

Periostin基因在多種惡性腫瘤中具有促進腫瘤生長和進展的活性。以RNA干擾技術(shù)沉默前列腺癌細(xì)胞株LNCap的periostin表達，細(xì)胞體外和體內(nèi)(移植瘤)生長速度均明顯減慢，體外遷移能力降低［5］。對于periostin低表達的胰腺癌細(xì)胞株［6］和肺腺癌細(xì)胞株［7］，表達外源性 periostin可促進細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。以periostin中和抗體處理存在periostin表達的小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1，可顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，延長細(xì)胞存活時間［8］。對于非腫瘤細(xì)胞如分化的哺乳動物心肌細(xì)胞［9］和皮膚成纖維細(xì)胞［10］，periostin 同樣顯示出促細(xì)胞增殖活性。除促進腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲外，研究［3］發(fā)現(xiàn)periostin過表達尚與腫瘤細(xì)胞化療耐藥性的獲得有關(guān)。既往研究［2，3］顯示periostin參與了胃癌細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移，本實驗利用前期研究構(gòu)建的表達人periostin全長序列的重組質(zhì)粒，進一步探討過表達periostin基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞化療敏感性的影響，以明確該基因是否有望作為胃癌的潛在治療靶點。

本實驗流式細(xì)胞分析顯示，常用化療藥物順鉑和5-Fu均能劑量依賴性地誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞株SGC7901凋亡，過表達periostin基因的SGC7901細(xì)胞則對順鉑和5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著抗性。本課題組前期研究［4］發(fā)現(xiàn)上調(diào) SGC7901細(xì)胞的periostin基因表達對細(xì)胞增殖能力無明顯影響，結(jié)合本實驗細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果，提示以基因轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達periostin對SGC7901細(xì)胞的主要作用為增強其對化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗能力，從而抑制其化療敏感性。

細(xì)胞凋亡途徑主要有兩條:一條是通過細(xì)胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白酶caspases;另一條是通過線粒體釋放凋亡蛋白酶激活因子激活caspases。Caspases屬于半胱氨酸蛋白酶，其激活可引起胞內(nèi)重要蛋白降解，進而引起細(xì)胞凋亡［11］。本實驗應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測了一些凋亡相關(guān)蛋白在各組SGC7901細(xì)胞中的表達情況。線粒體細(xì)胞色素c可在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)或凋亡信號的作用下釋放至胞質(zhì)，作為凋亡誘導(dǎo)因子，與Apaf-1、caspase-9前體、ATP/dATP形成凋亡體，進而募集并激活細(xì)胞凋亡效應(yīng)分子caspase-3，引發(fā)caspases級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PARP定位于細(xì)胞核內(nèi)，與應(yīng)激條件下的DNA修復(fù)密切相關(guān)，對于細(xì)胞穩(wěn)定和存活具有重要意義。PARP在體內(nèi)是caspase-3的主要剪切對象，被剪切后失去酶活性而加重細(xì)胞的不穩(wěn)定性。PARP剪切被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)之一，亦被認(rèn)為是caspase-3激活的標(biāo)記。本實驗發(fā)現(xiàn)順鉑和5-Fu均可促進SGC7901細(xì)胞的線粒體細(xì)胞色素c釋放，同時caspase-3激活，PARP剪切增強，而過表達periostin基因可逆轉(zhuǎn) SGC7901細(xì)胞由順鉑、5-Fu誘導(dǎo)的上述蛋白表達變化，胞質(zhì)細(xì)胞色素c以及cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白表達均明顯下調(diào)，從分子水平證實periostin的抗凋亡活性與抑制線粒體依賴性凋亡途徑有關(guān)，這可能是periostin抑制人胃癌細(xì)胞化療敏感性的機制之一。本課題組后續(xù)擬開展相關(guān)動物實驗，探討periostin在體內(nèi)能否誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥性，從而明確其作為胃癌潛在治療靶點的可能性。

1 Ruan K，Bao S，Ouyang G.The multifaceted role of periostin in tumorigenesis［J］.Cell Mol Life Sci，2009，66(14):2219-2230.

2 Li JS，Sun GW，Wei XY，et al.Expression of periostin and its clinicopathological relevance in gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2007，13(39):5261-5266.

3 劉宇.Periostin在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的機制及臨床意義的研究［D］.長沙:中南大學(xué)，2011.

4 汪麗燕，李濱，劉艷華.上調(diào)Periostin基因表達對人胃癌細(xì)胞增殖的影響［J］.胃腸病學(xué)，2013，18(9):526-529.

5 Sun C，Zhao X，Xu K，et al.Periostin:a promising target of therapeutical intervention for prostate cancer［J］.J Transl Med，2011，9:99.

6 Ben QW，Jin XL，Liu J，et al.Periostin，a matrix specific protein，is associated with proliferation and invasion of pancreatic cancer［J］.Oncol Rep，2011，25(3):709-716.

7 Hong L，Sun H，Lv X，et al.Expression of periostin in the serum of NSCLC and its function on proliferation and migration of human lung adenocarcinoma cell line(A549)in vitro［J］.Mol Biol Rep，2010，37(5):2285-2293.

8 Kyutoku M，Taniyama Y，Katsuragi N，et al.Role of periostin in cancer progression and metastasis:inhibition of breast cancer progression and metastasis by anti-periostin antibody in a murine model［J］.Int J Mol Med，2011，28(2):181-186.

9 Kühn B，del Monte F，Hajjar RJ，et al.Periostin induces proliferation of differentiated cardiomyocytes and promotes cardiac repair［J］.Nat Med，2007，13(8):962-969.

10 Ontsuka K，Kotobuki Y，Shiraishi H，et al.Priostin，a matricellular protein，accelerates cutaneous wound repair by activating dermal fibroblasts［J］.Exp Dermatol，2012，21(5):331-336.

11 Lamkanfi M，F(xiàn)estjens N，Declercq W，et al.Caspases in cell survival，proliferation and differentiation［J］.Cell Death Differ，2007，14(1):44-55.