池玉梅， 李 瑤， 張 瑜，， 王琴霞， 崔小兵

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198）

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)靈敏度高、選擇性好，在復(fù)雜樣品的低含量組分定量分析和已知成分定性鑒別方面有許多相關(guān)報(bào)道。然而，由于LC-MS技術(shù)的多樣性及實(shí)驗(yàn)條件的多變性，在應(yīng)用于組分未知的復(fù)雜樣品的分析時(shí)，雖然陸續(xù)有化合物解析的報(bào)道［1-4］，但尚在規(guī)律探索中。

小毛茛（Ranunculus ternatus Thunb.）是毛茛科（Ranunculaceae）毛茛屬（Ranunculus）植物，20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)于河南省信陽及駐馬店地區(qū)，在我國長江中、下游以及臺灣地區(qū)均有分布，在民間為全草入藥應(yīng)用，國內(nèi)現(xiàn)有大量種植，其干燥塊根為中國藥典一部收載的中藥材貓爪草（Radix Ranunculi Ternati）［5］，現(xiàn)代藥理和臨床研究均表明貓爪草及其制劑對肺結(jié)核、淋巴結(jié)核和多種癌癥及淋巴瘤有顯著療效。前期研究顯示，貓爪草的黃酮類成分為其有效成分，莖葉的總黃酮苷含量大于2%［6］，遠(yuǎn)高于塊根中的0.2%［7］。本文采用超高效液相色譜／二極管陣列檢測器-電噴霧四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC／DAD-ESI／Q-TOF MS），在研究黃酮類成分的色譜、質(zhì)譜行為的基礎(chǔ)上，對小毛茛莖葉的黃酮類成分進(jìn)行解析，以期為小毛茛的藥學(xué)研究提供基礎(chǔ)，為LC-MS技術(shù)的應(yīng)用拓展思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與藥品

電噴霧離子源接口的四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF micro，美國 Waters公司）；超高效液相色譜（Acquity UPLC，美國 Waters公司）；光二極管陣列檢測器（eλPDA，美國 Waters公司）；質(zhì)譜工作站：Masslynx4.1。

甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），醋酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），鹽酸（分析純，上海中試化學(xué)試劑總公司），二次重蒸水（自制）。

對照品：木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、槲皮素（quercetin）、蘆丁（rutin）、異槲皮苷（isoquercitrin）、槲皮苷（quercitrin）（中國藥品生物制品檢定所，含量測定用）；芹菜素（apigenin）、楊梅素（myricetin）（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號080531，含量大于98.5%）；二氫楊梅素（dihydromyricetin）、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷（quercetin-4′-O-glucoside）（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，含量大于98.5%）；夏佛托苷（schaftoside）、異夏佛托苷（isoschaftoside）、山柰酚-7-O-葡萄糖苷（kaempferol-7-O-glucoside）、槲皮素-7-O-葡萄糖苷（quercetin-7-O-glucoside）、異鼠李素-7-O-葡萄糖苷（isorhamnetin-7-O-glucoside）（自制，歸一化法含量大于98.5%）。對照品結(jié)構(gòu)見表1。

小毛茛采于南京市周邊地區(qū)，去根曬干（經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物專家談獻(xiàn)和教授鑒定為真品）。

1.2 方法

1.2.1 黃酮對照品溶液

將各黃酮對照品配制為1g／L的甲醇貯備液，分析時(shí)用甲醇配制為0.5mg／L的混合溶液。

1.2.2 樣品處理

小毛茛莖葉醇提液：稱取0.5g小毛茛莖葉粉末（60目），置于具塞燒瓶中，加入70%（v／v）甲醇水溶液10mL，超聲處理30min（工作頻率40kHz，功率250W），取適量離心5min（12000r／min），取上清液，即得。

表1 黃酮對照品的結(jié)構(gòu)Table 1 Structures of flavone references

酸水解液：取上述醇提液5mL，蒸除溶劑，加入5mL 1mol／L鹽酸甲醇溶液回流水解，分別于水解15、30、120min取樣，加適量 NaOH 中和，離心5 min（12000r／min），取上清液，即得。

1.2.3 色譜條件

Acquity UPLC HSS T3色譜柱（50mm×2.1 mm，1.7μm）；乙腈（A）和0.1%醋酸水溶液（B）為流動(dòng)相，流速0.25mL／min；梯度洗脫程序：0～5 min為2.0%A～10%A，5～20min為10%A～20%A，20～30min為20%A～40%A，30～33 min為40%A；檢測波長200～460nm；柱溫30℃。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化；負(fù)離子模式檢測；檢測范圍m／z 60～1000；毛細(xì)管電壓2800V；樣品孔電壓20V；MCP檢測電壓2200V；噴霧氣流量50L／h，脫溶劑氣流量450L／h；脫溶劑溫度300℃，離子源溫度110℃；一級質(zhì)譜碰撞能量3V；二級質(zhì)譜碰撞能量20～30V。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 黃酮對照品的分析

取混合黃酮對照品溶液，按1.2.3節(jié)與1.2.4節(jié)的方法進(jìn)行分析，提取色譜、光譜、質(zhì)譜信息，分析與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。

1.3.2 小毛茛莖葉的分析

分別對小毛茛莖葉的醇提液和酸水解液進(jìn)行UPLC-MS分析，提取符合黃酮類成分紫外光譜特征的對應(yīng)離子峰，進(jìn)行UPLC-MS／MS分析，提取色譜、光譜、質(zhì)譜信息，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測化合物。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮類化合物的色譜、光譜與質(zhì)譜特性

2.1.1 保留時(shí)間

以［M-H］-為檢測離子，選擇m／z 319、563、285、269、463、609、447、477、317、301和315檢測，黃酮對照品的UPLC-MS總選擇離子色譜圖見圖1。

圖1顯示，在反相色譜中，保留時(shí)間與取代羥基及苷化的數(shù)目和位置具有相關(guān)性。

圖1 黃酮對照品的UPLC-MS總選擇離子色譜圖（序號同表1）Fig.1 UPLC-MS chromatogram of total selective ions of flavone references（The numbers are the same as in Table 1）

對于同類化合物，苷元的羥基數(shù)目越多保留時(shí)間越小，如楊梅素（No.8，本節(jié)中化合物的序號均為表1中序號）、槲皮素（No.12）和山柰酚（No.15），保留時(shí)間依次在14.2、20.0和23.2min；再如木樨草素（No.13）和芹菜素（No.14），保留時(shí)間分別在20.5min和22.8min。在同分異構(gòu)體苷元中，若C環(huán)3位上有游離-OH，因能與4位羰基形成分子內(nèi)氫鍵，可使分子的疏水性增強(qiáng)，使保留時(shí)間增大，如山柰酚（No.15）與木樨草素（No.13），保留時(shí)間分別在20.5min和23.2min。

一般黃酮苷的保留時(shí)間小于相應(yīng)苷元的保留時(shí)間。糖苷化數(shù)目越多保留時(shí)間越小，如對照品2、3為雙取代糖苷，保留時(shí)間分別在6.7min和7.5 min，蘆?。∟o.5）是單取代二糖苷，保留時(shí)間在10.7min。

對于苷化位置，具有相同苷元的同分異構(gòu)體糖氧苷，若A環(huán)7位苷化，則比C環(huán)3位苷化使分子的疏水性減小幅度更大，保留時(shí)間更?。蝗鬊環(huán)4′位苷化，因3-OH與4-羰基形成分子內(nèi)氫鍵，使分子的疏水性減小的幅度小，因此保留時(shí)間為7位＜3位＜4′位，如對照品4、6和10，苷元均為槲皮素（No.12），分別為在7位、3位和4′位形成的葡萄糖氧苷，保留時(shí)間依次為10.6、11.6和14.5min。

此外，保留時(shí)間的大小與苷化糖基的關(guān)系與糖基的疏水性大小一致。如異槲皮苷（No.6）與槲皮苷（No.7），苷元與苷化位置均相同，糖基分別為葡萄糖與鼠李糖，保留時(shí)間分別為11.6min和13.7 min，前者疏水性小于后者。

2.1.2 紫外光譜特征

黃酮類化合物由桂皮?；捅郊柞；暙I(xiàn)形成吸收帶Ⅰ和吸收帶Ⅱ，其位置可以用于推測羥基的個(gè)數(shù)、位置和苷鍵的位置［8，9］。分析黃酮對照品的紫外光譜特征，結(jié)果顯示與資料一致，均有兩個(gè)特征吸收帶。

黃酮苷元和相應(yīng)黃酮碳苷的紫外吸收光譜相似，如夏腹托苷（No.2）和異夏腹托苷（No.3）是芹菜素（No.14）在6、8位形成的糖碳苷，其紫外光譜一致，吸收帶Ⅰ在328～350nm之間（與B環(huán)的取代羥基數(shù)有關(guān)），吸收帶Ⅱ在（266±5）nm；具有3位羥基的黃酮醇，其苷元的吸收帶Ⅰ在（366±5）nm（與B環(huán)的取代羥基數(shù)有關(guān)），吸收帶Ⅱ在250～270nm之間（與A環(huán)和B環(huán)的取代羥基數(shù)有關(guān)）；相應(yīng)的黃酮醇苷為3-OH取代苷化時(shí)，則吸收帶Ⅰ藍(lán)移至（350±5）nm，吸收帶Ⅱ變化不大；而游離3-OH的黃酮醇苷相似于相應(yīng)的苷元，如槲皮素-7-O-葡萄糖苷（No.4）與槲皮素（No.12）、山柰酚-7-O-葡萄糖苷（No.9）與山柰酚（No.15）、異鼠李素-7-O-葡萄糖苷（No.11）與異鼠李素（No.16），均有一致的光譜特征。二氫楊梅素（No.1）為二氫黃酮，無吸收帶Ⅱ，僅在290nm有吸收。

2.1.3 二級質(zhì)譜碎片

依據(jù)苷元、苷化數(shù)目及位置的代表性，圖2給出了部分對照品的LC-ESI／Q-TOF的二級質(zhì)譜圖。結(jié)果顯示，黃酮碳苷和氧苷的LC-MS／MS裂解形式有顯著差異，黃酮苷元與黃酮醇苷元的二級質(zhì)譜裂解形式也有一定差異，且母離子和脫糖基子離子的相對豐度與黃酮氧苷的苷化位置有一定的相關(guān)性。

有關(guān)黃酮氧苷的LC-MS／MS規(guī)律，陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道［1-4］。池玉梅等在文獻(xiàn)［10］中曾有探討，黃酮氧苷表現(xiàn)為丟失糖殘基，如六碳糖苷、五碳糖苷、甲基五碳糖苷和六碳糖醛酸苷分別為丟失162、132、146和176u。對于黃酮碳苷，六碳與五碳糖苷呈現(xiàn)的二級質(zhì)譜裂解規(guī)律分別為［M-H-90］-、［MH-120］-和［M-H-60］-、［M-H-90］-，如夏腹托苷（No.2）和異夏腹托苷（No.3）（圖2No.2、No.3），與相關(guān)報(bào)道［3，4］一致。

黃酮苷元的質(zhì)譜有2種裂解方式［8，9］，且以裂解方式Ⅰ（相當(dāng)于逆Diels-Alder（RDA）裂解）為主，即斷裂主要發(fā)生在C環(huán)的1位與2位和3位與4位，形成A1與B1兩個(gè)特征離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃酮苷元的LC-MS／MS裂解形式與之基本一致，如：木樨草素（圖2No.13）主要裂解為：C7H3（m／z 151）與 B-1：C8H5（m／z 133）；芹菜素（圖2 No.14）主要裂解為：C7H3（m／z 151）與：C8H5O-（m／z 117）；此外，LC-MS／MS尚有［M-H-CO-O］-：No.13 有 m／z 241（C14H9O-4）、No.14有 m／z 225（）；m／z 107（）為［A1-CO-O］-。

黃酮醇苷元的質(zhì)譜以裂解方式Ⅱ?yàn)橹鬟M(jìn)行裂解，［B2-28］-離子為其特征離子［8，9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃酮醇苷元的LC-MS／MS裂解形式與之不完全相符，且與B環(huán)的羥基數(shù)有關(guān)，若B環(huán)3′與4′位均存在羥基，其裂解主要發(fā)生在C環(huán)的2位與1位、3位間，隨之3位脫去CO。池玉梅等［10］曾依據(jù)高分辨質(zhì)譜的特點(diǎn)進(jìn)行了解析，如槲皮素（圖2No.12），主要裂解形成 A-：C8H3（m／z 179），脫CO成C7H3（m／z 151）與B-：C7H5（m／z 121）。若B環(huán)僅有單取代羥基，則LC-MS／MS裂解形式多樣，主要發(fā)生于C環(huán)脫CO方式，如山柰酚（圖2 No.15）和異鼠李素（圖2No.16），經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢索子離子化學(xué)組成和裂解形式推測見表2。羥基被甲基化的苷元，其裂解首先發(fā)生在脫甲基，如異鼠李素（圖2No.16）。

圖2 黃酮對照品的二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS／MS spectra of flavone references

高分辨質(zhì)譜不能分辨同分異構(gòu)體，MS／MS在解析結(jié)構(gòu)相近的黃酮糖苷同分異構(gòu)體時(shí)，若僅利用質(zhì)荷比信息，仍不能得以分辨，如槲皮素-7-O-葡萄糖苷（圖2No.4）、異槲皮苷（圖2No.6）和槲皮素-4′-O-葡萄糖苷 （圖 2No.10），［M-H］-均為C21H19（m／z463），均有m／z301（300）、179的碎片離子。但觀察黃酮糖氧苷同分異構(gòu)體的二級質(zhì)譜圖可發(fā)現(xiàn)，在相同的分析條件下，黃酮醇糖氧苷的母離子與苷元離子的相對豐度比例與糖苷化位置具有相關(guān)性。若苷化在黃酮醇A環(huán)的7位，其母離子［M-H］-的相對豐度最高，如槲皮素-7-O-葡萄糖苷（圖2No.4）的m／z 463的相對豐度最高、異鼠李素-7-O-葡萄糖苷（圖2No.11）的m／z 477的相對豐度最高；若苷化在黃酮醇B環(huán)，其苷元離子［M-H-gly］-的相對豐度為最高，如槲皮素-4′-O-葡萄糖苷（圖2No.10）的m／z301的相對豐度最高；若苷化在黃酮醇C環(huán)3位，其苷元離子以［M-2H-gly］-的相對豐度為最高，且存在如下現(xiàn)象：苷元離子同時(shí)呈現(xiàn)［M-H］-與［M-2H］-，相對豐度后者高于前者，如蘆?。▓D2No.5）、異槲皮苷（圖2 No.6）中m／z300均高于m／z301的相對豐度。

2.2 小毛茛莖葉成分解析

依據(jù)飛行時(shí)間質(zhì)譜能夠得到精確質(zhì)量數(shù)的特點(diǎn)，檢索母離子［M-H］-與碎片離子的化學(xué)組成。采用離子質(zhì)量數(shù)與計(jì)算質(zhì)量數(shù)相對誤差較小的原則（誤差小于5×10-6），結(jié)合考慮UV光譜圖與不飽和度的合理性，檢索化學(xué)式。小毛茛莖葉醇提液的各化合物的保留時(shí)間、紫外最大吸收波長、二級質(zhì)譜碎片及可能的化學(xué)式見表3，其中母核同表1的III結(jié)構(gòu)，R3″和 R4′均為 H。

圖3O-1、A-1分別為小毛茛莖葉醇提液總離子流圖和選擇離子色譜圖。

表3 小毛茛黃酮類成分的LC／DAD-MS數(shù)據(jù)及推測結(jié)果Table 3 LC-／DAD-MS data of flavonoids in Ranunculus ternatus Thunb.and identified results

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

圖3 樣品醇提液及其酸水解液的UPLC-MS色譜圖Fig.3 UPLC-MS chromatograms of the alcohol extract solution and its acid hydrolysis solutions of sample

根據(jù)二級質(zhì)譜信息，比對對照品的LC-MS／MS信息，推測小毛茛莖葉醇提液中含有3類黃酮醇苷元形成的糖氧苷類化合物，苷元分別為槲皮素（m／z 301）、異鼠李素（m／z 315）和山柰酚（m／z 285）；根據(jù)紫外光譜信息和二級碎片離子的相對豐度，推測3位均為氧苷。

參考黃酮醇糖氧苷的一般水解條件［11］，考察不同水解時(shí)間的溶液，驗(yàn)證苷元及苷化位置，酸水解液的LC-MS色譜圖見圖3中O-2～O-4、A-2～A-4。同法解析LC-MS、LC-MS／MS測試結(jié)果，根據(jù)黃酮糖氧苷水解脫糖基時(shí)間與糖苷位置的相關(guān)性［8］推測15min和30min水解液中均含有非3位苷化的黃酮；根據(jù)紫外光譜信息和二級碎片離子的相對豐度推測15min和30min水解液中含有在7位成氧苷的化合物，并且均為六碳糖苷（圖3中A-3）；120 min水解液的UPLC-MS測試結(jié)果顯示水解完全，符合7位苷化的特征；水解液測試結(jié)果顯示均含有槲皮素、異鼠李素和山柰酚；采用薄層色譜方法（具體實(shí)驗(yàn)步驟略）鑒定到水解液中還含有葡萄糖和鼠李糖糖基。

以表2中的1號化合物為例，紫外光譜有特征吸收帶254nm和348nm；母離子為m／z771，高分辨質(zhì)譜解析得化學(xué)式為C33H40O21；二級質(zhì)譜有槲皮素苷元的特征碎片m／z 301、179、151；根據(jù)子離子m／z609、463，分析可得（771-609）＝162、（771-463）＝308，分別為葡萄糖殘基與葡萄糖-鼠李糖殘基，兩者之和等于母離子與苷元之差（470u），結(jié)合m／z463與m／z462同時(shí)存在，且具有后者相對豐度高于前者的現(xiàn)象，推測C環(huán)3位連接葡萄糖-鼠李糖基，A環(huán)7位連接葡萄糖基，為雙取代糖氧苷，結(jié)合水解液的分析結(jié)果，推測1號化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖-鼠李糖-7-O-葡萄糖苷。

以此類推解析其他化合物，結(jié)果見表3，包括22個(gè)黃酮醇糖苷和3個(gè)苷元，與對照品4～7、9～12、15～16具有相對應(yīng)的苷元，相應(yīng)的糖苷化位置。

3 結(jié)論

采用LC-MS技術(shù)，利用對照品的色譜、質(zhì)譜特性，可以鑒別黃酮類成分同系物和一些同分異構(gòu)體，方法簡便。藥用植物小毛茛的莖葉含有豐富的黃酮類成分，可研究其潛在的藥用價(jià)值。本文僅就黃酮醇糖苷的色譜、質(zhì)譜特性進(jìn)行了初步探索，有關(guān)的規(guī)律及其應(yīng)用尚有待研究。

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