馬青蘭，王 楷，張 弛，曹秋芬，孟玉平

（1.太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，太原 030031）

土地和水是地球上重要的自然資源，然而在過(guò)去的幾十年里卻被各種復(fù)雜的有毒化合物污染，其中就包含重金屬[1]。2005年，廣東北江韶關(guān)段鎘嚴(yán)重超標(biāo)事件，2006年的湘江湖南株洲段鎘污染事故，2009年的湖南省瀏陽(yáng)市鎘污染事件，2012年廣西龍江河的鎘污染等，嚴(yán)重地威脅著人民的健康。重金屬鎘具有毒性，長(zhǎng)期接觸會(huì)引起慢性中毒，影響人體腎功能。常規(guī)的重金屬處理方法受經(jīng)濟(jì)技術(shù)指標(biāo)的限制有著局限性。利用基因工程構(gòu)建高選擇性基因工程菌，可以提高棗金屬硫蛋白（ZjMT）[2]與金屬離子的親和能力，增強(qiáng)微生物接受金屬離子的能力，對(duì)棗金屬硫蛋白的去除過(guò)程進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬不僅具有較高的研究?jī)r(jià)值，還能減少不必要的工作量，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，又節(jié)約原料。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)路延篤做過(guò)猴金屬硫蛋白對(duì)重金屬的吸附試驗(yàn)[3]；廈門大學(xué)鄧旭等人運(yùn)用基因工程技術(shù)處理重金屬?gòu)U水[4-5]；本研究項(xiàng)目成功提取了棗金屬硫蛋白，并把它導(dǎo)入大腸桿菌成功繁殖，用工程菌處理重金屬。該項(xiàng)目取得了國(guó)家專利，獲得了棗樹金屬硫蛋白基因的cDNA 序列，在國(guó)際基因庫(kù) DDBJ／EMBL／GenBank中的注冊(cè)序號(hào)是AB513130。本模型將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了整理，對(duì)米-門方程進(jìn)行了改進(jìn)，用MATLAB5.3擬合出數(shù)學(xué)模型，又通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)方程進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法提高了實(shí)驗(yàn)效率，降低了成本。

1 實(shí)驗(yàn)材料儀器和方法

1.1 菌株

試驗(yàn)中所用的菌株均由山西省農(nóng)科院生物研究所提供。宿主菌為E.coli BL21（DE3），導(dǎo)入載體pGEX-4T-2的對(duì)照菌pGEX-B和導(dǎo)入重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-ZjMT的基因工程菌pGEX-ZjMT-B。其中，基因工程菌pGEX-ZjMT-B是以從棗樹的cDNA文庫(kù)中獲得的基因SpotⅠ-MT為模板，用PCR方法擴(kuò)增出MT基因225bp特異片段，將其亞克隆入pBluesciptIⅡSK-T載體，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ分別酶切重組pBluesciptⅡSKT質(zhì)粒和原核表達(dá)載體PET28a，然后將MT基因片段和表達(dá)載體PET28a通過(guò)T4DNA連接酶進(jìn)行定向連接，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切和PCR方法雙重鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.2 基因工程菌pGEX-ZjMT-B處理重金屬鎘的作用機(jī)理

1）直接機(jī)理。基因工程菌pGEX-ZjMT-B應(yīng)用紫外光譜、圓二色譜等方法研究確定其有許多孤對(duì)電子，可以和重金屬離子諸多空軌道形成穩(wěn)定的配合物和螯合物。

2）間接機(jī)理。金屬離子在細(xì)胞表面的吸附，即細(xì)胞外多聚物和胞壁上的官能團(tuán)與金屬離子結(jié)合的被動(dòng)吸附。去除機(jī)理中吸附作用是在5min左右完成，螯合作用在整個(gè)去除過(guò)程起關(guān)鍵作用，發(fā)生在0～48h之間。前兩個(gè)小時(shí)生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20～24 h之間，pGEX-ZjMT-B基本進(jìn)入穩(wěn)定期，往后進(jìn)入衰減期。

1.3 主要儀器

本實(shí)驗(yàn)采用的主要儀器有SHY-2A型水浴恒溫振蕩器，722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)，LRH-250-Ⅱ培養(yǎng)箱，101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，SW-CJ-1D無(wú)菌操作臺(tái)，高壓鍋等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1）先準(zhǔn)備30個(gè)型號(hào)相同的培養(yǎng)皿，用稀硝酸浸泡12h后用去離子水清洗，在無(wú)菌室晾干；稱取NaCl 2.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1g，放入200 mL蒸餾水中充分?jǐn)嚢枞芙?，密封好?21℃高壓鍋中滅菌，使用時(shí)加熱到40℃。把培養(yǎng)皿分三組，每組10個(gè)；把原菌液用去離子水依不同比例稀釋，稀釋后按稀釋順序給第一組培養(yǎng)皿分別加入1mL的菌液，再做兩個(gè)平行樣。把40℃的培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)皿，待凝固后倒置于4℃的培養(yǎng)箱，24h后取出，按網(wǎng)格法數(shù)出菌落數(shù)，計(jì)算平均值求得ln nCF。以培養(yǎng)基為對(duì)照，分別測(cè)出不同時(shí)間下600nm的吸光度值（DO600）。

2）取500μL已活化培養(yǎng)的菌液加入到50mL LB新鮮培養(yǎng)基中，記錄移入菌體的時(shí)間，并測(cè)量初始的DO600值，37℃振蕩培養(yǎng)。每隔一定的時(shí)間測(cè)量DO600，當(dāng)DO600為-0.06左右時(shí)，加入 Cd2＋，觀察不同濃度下，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的變化。記錄取樣時(shí)間，每隔兩小時(shí)依次取樣測(cè)定DO600的值。

2 基因工程菌pGEX-ZjMT-B增長(zhǎng)率和Cd2＋濃度的數(shù)學(xué)模型

基于米-門方程，建立了基因工程菌pGEXZjMT-B增長(zhǎng)率和Cd2＋濃度的數(shù)學(xué)模型。為研究重金屬Cd2＋對(duì)基因工程菌pGEX-ZjMT-B增長(zhǎng)率的影響，首先要建立鎘離子濃度對(duì)菌生長(zhǎng)情況影響的關(guān)系式。模型中所用的數(shù)據(jù)以最小二乘法求得。筆者認(rèn)為，去除重金屬是一個(gè)快速的反應(yīng)過(guò)程，可忽略菌的內(nèi)原代謝。對(duì)其結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，這樣做既方便數(shù)學(xué)模型的建立，又符合實(shí)際工程運(yùn)用。

3 數(shù)學(xué)模型建立過(guò)程

3.1 數(shù)學(xué)模型建立

不同Cd2＋含量溶液中基因工程菌pGEXZjMT-B的平均生長(zhǎng)速率的變化值見(jiàn)表1所示。

表1 pGEX-ZjMT-B的平均生長(zhǎng)速率

根據(jù)表1，擬合一次線性方程得：

DO600的平均變化值即基因工程菌pGEX-ZjMT-B的生長(zhǎng)速率，用MATLAB5.3軟件的優(yōu)化工具中任意曲線擬合出DO600和lg nCF的函數(shù)方程為：

這個(gè)方程的建立可以方便地從DO600直接求出菌濃度的值，如圖1所示。

圖1 DO 600和菌濃度的關(guān)系

由式（2）式（3）可以得出，菌濃度lgnCF和 Cd2＋濃度的關(guān)系式，聯(lián)合米-門方程最終得出我們想要的基因工程菌pGEX-ZjMT-B增長(zhǎng)率和Cd2＋濃度的數(shù)學(xué)模型如下：

3.2 模型驗(yàn)證

比較方程結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，方程和試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

表2 方程結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)果與討論

4.1 方程系數(shù)的求解

本模型的建立是在基因工程菌最佳生長(zhǎng)條件下進(jìn)行的，并假定它對(duì)鎘的去除是一個(gè)快速的反應(yīng)過(guò)程。在菌被激活后不斷測(cè)定DO600值，直到DO600＝-0.06，此時(shí)它的生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，細(xì)胞生長(zhǎng)不受限制，而且

4.2 兩種測(cè)量菌濃度方法的差異

傳統(tǒng)上是把DO600直接看做菌濃度，而這種方法有太多不便和不合理。例如，在使用分光光度計(jì)時(shí)對(duì)照液的選取，有時(shí)用蒸餾水，有時(shí)用原液；本實(shí)驗(yàn)用的是原培養(yǎng)基，這就造成DO600測(cè)量值明顯不同，如圖2所示。圖中，菌種的質(zhì)量濃度分別為0，300，600，900，1200μg／L.從圖中可以看到一種變化趨勢(shì)，并能表示不同鎘離子濃度下DO600的變化。圖3是lgnCF隨時(shí)間變化的曲線。

圖2 不同濃度Cd2＋對(duì)菌生長(zhǎng)情況的影響

圖3 菌隨時(shí)間的變化

用DO600表示菌濃度簡(jiǎn)單方便，能表示工程菌生長(zhǎng)的基本趨勢(shì)。雖然用擬合的方程直接求菌濃度，方法很麻煩，而且每種菌的曲線有差異，但是它能直接得出菌濃度，計(jì)算中需要用菌濃度時(shí)就方便了，并且從方程中可以求得任意時(shí)間的菌濃度，不需要每次都測(cè)量，省時(shí)省力。雖然f（x）有增減區(qū)間，但是f（x）是恒大于零的。因此，基因工程菌pGEX-ZjMT-B的增長(zhǎng)速率是減小的，這與圖（2）顯示相吻合。而圖3更清晰地展示了工程菌生長(zhǎng)的曲線，經(jīng)過(guò)多次線性擬合發(fā)現(xiàn)六次方程吻合性更高，但為了計(jì)算方便可換成低次計(jì)算。

5 結(jié)論

本文提出的方法改進(jìn)了傳統(tǒng)菌濃度的測(cè)定方式，繼承了米-門方程的優(yōu)點(diǎn)。又由于基因工程菌對(duì)鎘離子的去除是一個(gè)快速的過(guò)程，省去了內(nèi)原代謝過(guò)程。從定性定量方面都比較客觀地反應(yīng)了菌濃度真實(shí)的狀況。該模型層次清楚，意義明確。由于每種菌的生長(zhǎng)曲線不同，方程只適用于工程菌pGEXZjMT-B。

[1]Jenne E A，Avotins P.The time stability of dissolved mercury in water samples[J].Environ Qual，1975（4）：427-431.

[2]韓彩云，曹秋芬，馬青蘭.棗金屬硫蛋白基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J].太原理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（4）：388-390.

[3]路延篤，黃巧云.猴金屬硫蛋白α域（MT-αCDNA）突變體的構(gòu)建、表達(dá)及工程菌對(duì)重金屬的吸附[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（9）：1763-1770.

[4]蔡穎，趙肖為，鄧旭，等.基因工程菌生物富集廢水中重金屬[J].水處理技術(shù)，2006，32（1）：26-29，65.

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