張曉晶，鐘相根，賈 旭，鄧秀蘭，王青青，鄭子安，王 坦

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

左歸丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠IL-23/IL-17炎性軸的影響

張曉晶，鐘相根*，賈 旭，鄧秀蘭，王青青，鄭子安，王 坦

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

目的：探討左歸丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE)IL-23/IL-17炎性軸的影響。方法：建立髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(myelinoligodendrocyteglycoprotein35-55,MOG35-55)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠EAE模型，隨機(jī)分為模型組、潑尼松組、左歸丸組，并設(shè)正常對(duì)照組。觀察小鼠的發(fā)病情況、神經(jīng)功能評(píng)分及體質(zhì)量變化，HE染色觀察CNS病理?yè)p傷程度,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠腦組織IL-23p19、IL-17mRNA表達(dá)。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組腦組織IL-23p19、IL-17mRNA表達(dá)顯著升高。左歸丸及潑尼松組小鼠腦組織IL-23p19、IL-17mRNA表達(dá)比模型組低(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：左歸丸能夠抑制IL-23/IL-17炎性軸而起到抗炎作用。

多發(fā)性硬化；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；左歸丸；IL-23/IL-17炎性軸；小鼠

多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis，MS)是一種緩慢進(jìn)展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性炎性脫髓鞘疾病[1]，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。新近研究表明，IL-23/IL-17炎性軸在多發(fā)性硬化癥發(fā)病中起關(guān)鍵作用[2]。目前，西醫(yī)尚無(wú)特效療法,臨床上治療多發(fā)性硬化癥的藥物包括糖皮質(zhì)激素、β-干擾素、環(huán)孢霉素A等。這些藥物雖可明顯改善多發(fā)性硬化癥患者急性期的臨床癥狀，但尚無(wú)循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)表明其可有效控制疾病復(fù)發(fā)及減緩疾病進(jìn)展，而且由于不良反應(yīng)限制了它們的臨床應(yīng)用，不宜作為長(zhǎng)期維持治療用藥。

近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者研究表明[3-4]，左歸丸可有效治療大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)。本研究觀察左歸丸對(duì)EAE小鼠腦組織IL-23p19、IL-17mRNA的影響，探討左歸丸能否通過(guò)抑制IL-23/IL-17炎性軸，進(jìn)而治療EAE。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雌性，40只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2007-0001]，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑及儀器MOG35-55，純度>97.25%，肽序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(生工生物工程(上海)有限公司)。完全弗氏佐劑(CompleteFreud’sAdjuvant，CFA)購(gòu)于sigma。百日咳毒素(Pertussistoxin)來(lái)源于Bordetellapertusssis。人結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis，H37Ra)(Difcocompany，USA)。TRIpureReagent(北京艾德萊生物科技有限公司)。M-MuLV(反轉(zhuǎn)錄酶 200U/μL)購(gòu)于Fermentas(MBI)公司。RNaseInhibitor購(gòu)于Fermentas(MBI)公司。Miniopticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將EAE小鼠隨機(jī)分為：模型組、潑尼松組、左歸丸組，另設(shè)正常對(duì)照組，共4組。免疫后，按組別分別做如下處理：模型組每天給與生理鹽水灌胃；潑尼松組每天給與生理鹽水灌胃，發(fā)病后改為醋酸潑尼松混懸液(7mg/kg，用生理鹽水配制成要求的濃度)；左歸丸組每天給與左歸丸(2.8g/kg，用生理鹽水配制成要求的濃度)混懸液灌胃。正常對(duì)照組，相同條件和環(huán)境中飼養(yǎng)，不作任何處理。

每組實(shí)驗(yàn)小鼠在造模后于免疫后第30天取材。取腦組織按realtime-PCR方法要求處理樣品待測(cè)；HE染色觀察取材用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠，剪開胸部，將灌注針由左心室穿入主動(dòng)脈，依次注入0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛。經(jīng)心灌注30min后，完整取出腦組織固定于0.1kg/L福爾馬林磷酸緩沖液中24h，石蠟包埋以備切片。取出石蠟塊連續(xù)切片，5μm切片行HE染色。

1.4 小鼠EAE模型建立 按照課題組建立的方法[5]構(gòu)建EAE小鼠模型。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將MOG35-55(4mg/mL，用滅菌后PBS配制相應(yīng)濃度)與等體積的CFA(含4mg/mL的H37Ra)用已經(jīng)滅菌玻璃注射器充分乳化。用乙醚麻醉C57BL/6小鼠，分三點(diǎn)給小鼠背部皮下注射(100μL/只)乳化液。背部?jī)杉缯?、后背部中線兩側(cè)各33.3μL。最終每只小鼠皮下注射的MOG35-55和H37Ra均為200μg。在免疫當(dāng)天給每只小鼠腹腔注射400ngPTX。在免疫72h后給每只小鼠再次腹腔注射400ngPTX。

1.5 小鼠神經(jīng)功能評(píng)分 從初次免疫第0天起至第30天實(shí)驗(yàn)終止前，采用盲法，每天2人至少一次在同一時(shí)間按Benson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)EAE嚴(yán)重性進(jìn)行臨床評(píng)估。0分，沒有明顯疾病癥狀；1分，尾巴張力消失或者后肢無(wú)力；2分，尾巴張力消失和后肢無(wú)力；3分，后肢部分癱瘓；4分，后肢完全癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或者死亡。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime-PCR)檢測(cè)腦組織IL-23p19、IL-17mRNA表達(dá) 取腦組織約100mg，常規(guī)TRIzol提取總RNA，經(jīng)260nm和280nm測(cè)定其吸光度比值在1.8～2.0為純度合格。用RT-PCR試劑盒合成cDNA,再以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(操作方式按照試劑盒說(shuō)明)，引物序列見表1所示。PCR反應(yīng)條件如下:GAPDH和IL-23的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5min預(yù)變性后，95 ℃ 30s→65 ℃ 30s(熒光檢測(cè))，41個(gè)循環(huán)。IL-17的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5min預(yù)變性后，95 ℃ 20s→68 ℃30s→72 ℃ 30s(熒光檢測(cè))，41個(gè)循環(huán)。同時(shí)做溶解曲線來(lái)確認(rèn)是否為單一峰。反應(yīng)結(jié)束后，以瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物是否符合原設(shè)計(jì)片段長(zhǎng)度。

結(jié)果判定：PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集于LightCycler2.0系統(tǒng)上進(jìn)行，記錄其循環(huán)閾值(CT)，以相對(duì)定量公式2-ΔΔCT計(jì)算每個(gè)樣品中靶基因的相對(duì)mRNA表達(dá)，其中ΔCt值=靶基因Ct值-GAPDHCt值。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1EAE小鼠發(fā)病率、神經(jīng)功能評(píng)分及體質(zhì)量變化 免疫誘導(dǎo)后15d開始，小鼠逐漸發(fā)病，表現(xiàn)為活動(dòng)減少、體質(zhì)量減輕、尾部及四肢無(wú)力，符合EAE小鼠模型表現(xiàn)。左歸丸及潑尼松干預(yù)后發(fā)病率降低、神經(jīng)功能評(píng)分及體質(zhì)量減輕均明顯改善。各組小鼠發(fā)病率、神經(jīng)功能評(píng)分、體質(zhì)量變化分別見下圖1、圖2、圖3。

圖1 各組小鼠發(fā)病率比較

圖2 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

圖3 各組小鼠體質(zhì)量變化比較

2.2EAE小鼠腦組織病理改變HE染色觀察，正常對(duì)照組未見明顯的炎癥改變。EAE模型組小鼠大腦實(shí)質(zhì)內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分微血管周圍被炎癥細(xì)胞圍繞，形成典型的“血管袖套樣”改變。左歸丸及潑尼松組腦組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善。

表2 各組腦組織IL23 p19、IL-17 mRNA表達(dá)比較(n=6)

注：vscontrolgroup，#P<0.05，##P<0.01；vsEAEgroup，*P<0.05，**P<0.01。

2.3IL-23p19、IL-17mRNA的表達(dá) 如表2所示，模型組IL-23p19、IL-17mRNA比正常組表達(dá)增加(P<0.01)。與模型組比較，左歸丸及潑尼松組表達(dá)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎與人類多發(fā)性硬化(MS)的病理變化極其相似，是研究MS的經(jīng)典動(dòng)物模型。長(zhǎng)期以來(lái)，EAE/MS被認(rèn)為是以IL-12誘導(dǎo)的Thl細(xì)胞反應(yīng)為主的自身免疫性疾病。然而，一系列的矛盾困擾著人們。如IL-12是Thl分化的關(guān)鍵因子，IL-12基因敲除小鼠仍能產(chǎn)生EAE[6]。IFN-γ是Thl的重要致病因子，然而IFN-γ基因敲除小鼠仍能誘導(dǎo)產(chǎn)生EAE，而且恢復(fù)緩慢。Thl7細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和IL-23功能的研究，解釋了以上的困惑。

Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一類CD4+細(xì)胞亞群，因其獨(dú)特的表型特征和分泌IL-17而得名，是和Th1細(xì)胞亞群、Th2細(xì)胞亞群相對(duì)應(yīng)的一組細(xì)胞亞群[7-8]。Th17細(xì)胞亞群具有高度的致病性，Th17細(xì)胞和IL-17在EAE的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用[9]。Th17細(xì)胞通過(guò)分泌一系列的促炎因子如IL-17、IL-17F、TNF-α、IL-6而發(fā)揮作用。IL-17作為IL-17家族的代表性因子，可以發(fā)現(xiàn)在EAE中表達(dá)升高；IL-17基因敲除小鼠對(duì)EAE不敏感；抗IL-17抗體可以使EAE癥狀明顯減輕[10]。

IL-23是新近發(fā)現(xiàn)IL-12家族細(xì)胞因子。IL-23由p19和p40兩個(gè)亞基組成，而IL-12由p35和p40亞基組成，兩者有共同亞基p40。IL-12p35亞基敲除小鼠仍能誘導(dǎo)產(chǎn)生EAE，而出人意料的是，當(dāng)IL-12p40亞基敲除和IL-23p19亞基敲除小鼠不能誘導(dǎo)產(chǎn)生EAE[11]。使用IL-23p19亞基抗體處理EAE，可使小鼠臨床癥狀減輕，IL-17分泌降低[12]。結(jié)果證實(shí)IL-23而不是以往所認(rèn)為的IL-12在EAE中發(fā)揮核心作用，即IL-23比IL-12更為關(guān)鍵[11]。

但是IL-23不是產(chǎn)生Thl7細(xì)胞的必須條件，單獨(dú)的IL-23不能誘導(dǎo)幼稚性NaiveCD4+細(xì)胞向Thl7細(xì)胞分化，只能誘導(dǎo)記憶性CD4+細(xì)胞向Thl7細(xì)胞分化，但I(xiàn)L-23在促進(jìn)IL-17分泌，維持和增強(qiáng)Th17細(xì)胞效應(yīng)功能方面起著關(guān)鍵性作用[13]，稱為IL-23/IL-17軸[4,15]。據(jù)此，最近有學(xué)者提出了EAE/MS的IL-23/IL-17炎性軸發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)。

既往研究表明，中醫(yī)藥防治MS具有較明顯的學(xué)科優(yōu)勢(shì)[16-17]，如左歸丸可有效治療大鼠EAE。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，左歸丸可改善EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分，抑制EAE小鼠腦組織IL-23p19、IL-17mRNA表達(dá)。提示左歸丸可通過(guò)抑制IL-23/IL-17炎性軸而起到抗炎治療作用，進(jìn)而改善EAE神經(jīng)功能評(píng)分。

可見，左歸丸能夠通過(guò)影響IL-23/IL-17炎性免疫發(fā)病軸，起到抗炎治療作用，為左歸丸在多發(fā)性硬化中的應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。

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R744.5 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

A

1003-5699(2013)06-0615-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30901909);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金新教師基金項(xiàng)目(200800261037)。

張曉晶(1968-)，男，實(shí)驗(yàn)師。研究方向：

*[通信作者] 鐘相根，男，醫(yī)學(xué)博士，教授。Tel：010-64286194，E-mail：zhongxg@bucm.edu.cn。

2013-01-12)