解旭卓，曹慧玲，鹿芹芹，陳瑞卿，郭云珠，周伯儒，尹大川

西北工業(yè)大學(xué) 生命學(xué)院空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710072

蛋白質(zhì)結(jié)晶的研究歷經(jīng)了從偶然性地好奇觀察、有目的地純化及蛋白純度檢驗(yàn)，到目前對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的發(fā)展過程。通過這個(gè)歷程，人們對(duì)蛋白質(zhì)晶體的性質(zhì)已有了較清晰的認(rèn)識(shí)。

長期以來，人們從多個(gè)角度對(duì)蛋白質(zhì)晶體的物理性質(zhì)進(jìn)行了較為深入的研究，這對(duì)理解蛋白質(zhì)結(jié)晶機(jī)理，進(jìn)而更好地幫助實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)晶，顯然是有利的。但是，迄今尚無系統(tǒng)整理這些研究成果的文獻(xiàn)。基于此，我們首先從整體上描述了蛋白質(zhì)晶體的物理性質(zhì)，然后分別介紹了相關(guān)的密度、機(jī)械性能、聲學(xué)、熱學(xué)、光學(xué)等性質(zhì)，最后在此基礎(chǔ)上總結(jié)了區(qū)分普通蛋白質(zhì)晶體的方法，并進(jìn)行評(píng)述。

1 蛋白質(zhì)晶體的物理性質(zhì)

蛋白質(zhì)晶體是溶液中隨機(jī)分布的蛋白質(zhì)分子經(jīng)規(guī)則排列堆積形成的有序聚集體，其特征是由有序的結(jié)構(gòu)框架和包裹的溶劑分子（主要是水分子）共同形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈多孔性晶體。相對(duì)于常規(guī)固態(tài)晶體，蛋白質(zhì)晶體中蛋白質(zhì)分子間的相互作用很弱，水分子對(duì)穩(wěn)定其多孔狀態(tài)發(fā)揮重要作用。作為棱面晶體，蛋白質(zhì)晶體具有規(guī)則的幾何外形，通常呈現(xiàn)出銳利的棱、角，以及光滑的平面。

1.1 晶體密度

水基結(jié)晶液的密度通常略大于水，而晶體密度又略大于溶液。因此晶體在沒有貼附壁面時(shí)，一般會(huì)沉降到結(jié)晶液底部[1-2]。

1.2 機(jī)械性能

蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)松散，在溫和的液體環(huán)境中易破裂、易粉碎、易溶解[3-4]，目前研究涉及機(jī)械性能的指標(biāo)主要有硬度、彈性模量和塑性。蛋白質(zhì)晶體的機(jī)械硬度不高，隨室溫暴露時(shí)間的延長顯著增加后趨于穩(wěn)定。彈性模量可用于估計(jì)蛋白質(zhì)晶體堆積的緊湊程度，但其測(cè)量結(jié)果差異較大，常常與測(cè)量技術(shù)有關(guān)。根據(jù)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，也可通過計(jì)算機(jī)模擬彈性模量。蛋白質(zhì)晶體非常脆弱，基本不存在塑性，因此除了一篇利用計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算涉及到蛋白質(zhì)晶體的塑性研究報(bào)道外[5]，目前還沒有針對(duì)塑性方面的實(shí)驗(yàn)研究。

如前所述，晶體內(nèi)部的水分子對(duì)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起到很大的作用。據(jù)此，Tait等[6]認(rèn)為雞蛋清溶菌酶（hen egg-white lysozyme，HEWL）晶體中水分子蒸發(fā)或溢出，晶體體積減小，致使蛋白質(zhì)分子相互作用增強(qiáng)，從而硬度增加、彈性模量增大。

1.3 聲學(xué)性質(zhì)

蛋白質(zhì)晶體HEWL的＜110＞面［001］和［110］方向的聲傳導(dǎo)速度并不相同，也受溫度、pH值和溶劑影響。Tachibana等認(rèn)為脫水后HEWL體積減小，分子間相互作用加強(qiáng)，導(dǎo)致聲傳導(dǎo)速率增加[7-10]，可見自由穿透的水分子與蛋白質(zhì)晶體的聲傳導(dǎo)速率密切相關(guān)。由此，證明蛋白質(zhì)晶體呈現(xiàn)多孔性的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.4 熱學(xué)性質(zhì)

晶體在冷凍過程中的傳熱現(xiàn)象受到關(guān)注[11]，主要研究晶體與冷媒之間的傳熱問題，包括三個(gè)方面：晶體向冷媒的傳熱系數(shù)，在冷凍瞬間晶體內(nèi)部溫度分布差異，以及相應(yīng)的因溫度差異導(dǎo)致的晶體內(nèi)部應(yīng)變。而晶體自身的熱導(dǎo)率（thermal conductivity）并無實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)，早期有向結(jié)晶溶液中添加HEWL晶體，進(jìn)而測(cè)量晶體與溶液混合后熱導(dǎo)率的報(bào)道[12]，發(fā)現(xiàn)添加HEWL晶體后，溶液的熱導(dǎo)率大幅下降；但是隨著蛋白質(zhì)晶體含量的增加，熱導(dǎo)率逐漸提高，其具體數(shù)值范圍為0.26～1.02 W/（m·℃）。由此可知晶體自身的熱導(dǎo)率大體數(shù)量級(jí)范圍，但其估計(jì)值約為0.6～5.0 W/（m·K）（在100 K到室溫之間）[11]。

1.5 光學(xué)性質(zhì)

1.5.1 折射率與雙折射現(xiàn)象 Jones等[13]測(cè)量了溶菌酶晶體的折射率，發(fā)現(xiàn)與晶體中的溶劑含量有很大關(guān)系：晶體在含水飽和狀態(tài)下，其折射率范圍為1.49～1.56，但在空氣中暴露后隨著失水量的增加，其折射率逐步增加。多數(shù)蛋白質(zhì)晶體都具有各向異性，在光學(xué)上表現(xiàn)為雙折射現(xiàn)象（即存在2個(gè)折射率），在偏光顯微鏡下旋轉(zhuǎn)檢偏片觀察晶體時(shí)，晶體呈現(xiàn)多彩條帶[14]。但并不是所有晶體都有各向異性，如細(xì)菌分裂相關(guān)蛋白FtsZ[15]。通常情況下，我們并不能確定目標(biāo)蛋白質(zhì)晶體是否具有各向異性。

1.5.2 熒光現(xiàn)象 除了測(cè)量光學(xué)參數(shù)外，對(duì)蛋白質(zhì)晶體的光吸收與激發(fā)也有一定的研究。紫外光下，蛋白質(zhì)晶體一般能發(fā)出熒光。芳香族氨基酸吸收紫外光并釋放熒光，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的吸收光譜范圍為260～310 nm，其中色氨酸的熒光效應(yīng)最強(qiáng)，在280 nm處達(dá)到最大吸收峰，釋放300～450 nm的熒光，最強(qiáng)可視光譜為340～360 nm[16]。蛋白質(zhì)分子堆積越密集，熒光強(qiáng)度越高，因此，蛋白質(zhì)晶體因含有較大密度的芳香基，比其結(jié)晶液釋放更多的熒光[17]，從背景色中突顯出來，即使晶體嵌入沉淀中也能檢測(cè)到熒光[18]，可應(yīng)用此性質(zhì)快速鑒別蛋白質(zhì)晶體。部分蛋白質(zhì)分子不含色基酸，如胰島素，基本不具備上述性質(zhì)，但能連接可發(fā)熒光的小分子，輔助鑒別蛋白質(zhì)晶體。

2 根據(jù)物理性質(zhì)鑒別蛋白質(zhì)晶體

在蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)條件篩選、優(yōu)化過程中，蛋白質(zhì)晶體（包括單晶、孿晶、微晶等）與非晶態(tài)的聚集體、自由的蛋白質(zhì)分子，并隨同緩沖液和沉淀劑中的鹽晶、不規(guī)則沉淀等共存于結(jié)晶液中，給目標(biāo)蛋白質(zhì)晶體的檢測(cè)和鑒別帶來困難。進(jìn)行X線晶體衍射之前，在篩選未知蛋白的結(jié)晶條件過程中，若恰當(dāng)?shù)罔b別蛋白質(zhì)晶體，能減少蛋白用量、降低成本、提高效率，因此準(zhǔn)確、高效地鑒別蛋白質(zhì)晶體的方法一直是研究熱點(diǎn)。依據(jù)目前的技術(shù)，大體上可將鑒別蛋白質(zhì)晶體的方法分為低通量法和高通量法。

2.1 低通量法鑒別蛋白質(zhì)晶體

在已知蛋白質(zhì)晶體、鹽晶或沉淀劑晶體形貌、顏色情況下，可用普通光學(xué)或偏光顯微鏡直接觀察鑒別[14]。在未知情況下可采用如下方法：①脫水法：用晶體環(huán)固定晶體，較長時(shí)間暴露在空氣中，蛋白質(zhì)晶體由于脫水而損毀，鹽晶則不發(fā)生變化；②密度法：撈出晶體，輕放在結(jié)晶液滴上，蛋白質(zhì)晶體能短時(shí)間浮于表面，而鹽晶快速下沉；③硬度法：在低倍光學(xué)顯微鏡下，在結(jié)晶液中用針尖觸碰晶體，蛋白質(zhì)晶體偏軟，容易碎成粉狀，而鹽晶偏硬，容易碎裂成塊；④溶解法：用濕濾紙觸碰晶體，蛋白質(zhì)晶體很快溶解，而鹽晶需較長時(shí)間才能溶解；⑤灼燒法：撈出晶體放在蓋玻片上，火焰灼燒蓋玻片底部，顯微鏡下觀察蛋白質(zhì)晶體會(huì)由半透明狀變成純黑色粉末，也有毛發(fā)特有的燒焦味；⑥SDS-PAGE法：撈出晶體，在沉淀劑中輕蘸洗滌，經(jīng)電泳后判斷是否有目標(biāo)染色條帶；⑦對(duì)照法：參照鹽的溶解度和擴(kuò)散平衡時(shí)結(jié)晶液中的鹽濃度，判斷能否長出鹽晶，也可單獨(dú)培養(yǎng)鹽晶，根據(jù)形貌作對(duì)照鑒別等[19]；⑧偏光法：蛋白質(zhì)晶體和鹽晶都有較強(qiáng)的偏光性，利用此性質(zhì)能區(qū)別晶體和其他非晶態(tài)物質(zhì)（如玻璃壁上和結(jié)晶液內(nèi)的小氣泡、無定形沉淀等），效果顯著；⑨衍射法：即X線單晶衍射法，獲得衍射圖譜，解析結(jié)構(gòu)，進(jìn)而判定是否是蛋白質(zhì)晶體。

上述方法多具有破壞性，為了保護(hù)晶體可采用一些非破壞性的方法，如對(duì)照法和偏光法。

多數(shù)低通量鑒別方法并不完全可靠，往往因蛋白而異；最有說服力的方法是衍射法，根據(jù)衍射數(shù)據(jù)判斷是否為蛋白質(zhì)晶體，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力[20-21]，而且有時(shí)還存在一些不適合衍射的蛋白質(zhì)晶體，也不能應(yīng)用這種方法。

2.2 高通量法鑒別蛋白質(zhì)晶體

在后基因組時(shí)代，眾多的待解結(jié)構(gòu)的蛋白與不完善的高通量檢測(cè)技術(shù)之間的矛盾越來越尖銳，因此越來越多的科學(xué)家致力于該方面的研究。其中，在高通量鑒別蛋白質(zhì)晶體方面發(fā)展出了一系列的方法，并從多個(gè)角度進(jìn)行了改進(jìn)。主要包括可見光法、UV熒光法和SONICC技術(shù)（second-order nonlinear imaging of chiral crystals，手性晶體的二階非線性成像）。

2.2.1 可見光法 可見光法主要用于觀察晶體形貌，根據(jù)形貌判斷是否是晶體。普通光學(xué)顯微鏡下，晶體和沉淀從結(jié)晶液體的背景色中突顯出來，能夠看到晶體。高通量鑒別則可利用軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析從而自動(dòng)辨別，例如應(yīng)用一些自動(dòng)拍照系統(tǒng)獲得批量圖像，之后采用XREC、CrysPage[22-23]等軟件分析圖像，鑒別是否存在晶體。但這種方法也存在準(zhǔn)確性低的問題而受到質(zhì)疑[17]。除此之外，利用晶體的雙折射現(xiàn)象，可通過偏光顯微鏡得到彩色圖像，也可判斷是否存在晶體?？梢姽夥捎糜谂袛嗍欠翊嬖诰w，但對(duì)該晶體是否是蛋白質(zhì)晶體，卻無能為力。

2.2.2 UV熒光法 UV熒光法的主要作用在于區(qū)分鹽晶。在UV激發(fā)下，鹽晶保持灰暗，蛋白質(zhì)晶體則常會(huì)釋放熒光。這是一大突破，但仍存在一些實(shí)用局限性，如部分蛋白不產(chǎn)生熒光、熒光強(qiáng)度極弱且降低信噪比，蛋白質(zhì)晶體含水量太高導(dǎo)致與溶液背景熒光區(qū)分不大而不能凸顯、最適UV波長不確定且不統(tǒng)一，長時(shí)間UV照射易損毀晶體，結(jié)晶用的密封材料自身減弱或阻礙UV光線，非晶態(tài)蛋白質(zhì)聚集體也釋放一些熒光，不能高效檢測(cè)微小晶體等。這些局限性影響了該技術(shù)的使用效果。對(duì)此，可考慮采用一些優(yōu)化方案，如在分子水平共價(jià)連接上UV熒光因子，加入非特異性熒光因子等以放大蛋白內(nèi)在特征。

2.2.3 SONICC技術(shù) SONICC技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)晶體學(xué)領(lǐng)域而言是一個(gè)新興檢測(cè)技術(shù)，可用于區(qū)分蛋白質(zhì)晶體和非晶態(tài)蛋白質(zhì)、鹽等聚集體。該技術(shù)利用二次諧波（second-harmonic generation，SHG）作為圖像信號(hào)源檢測(cè)蛋白質(zhì)晶體[17]。所謂二次諧波，簡單說，是當(dāng)使用一束近紅外激光照射結(jié)構(gòu)有序的材料時(shí)，出射光波中包含波長減半、頻率倍增的光。通常當(dāng)被照射的研究對(duì)象具備非中心對(duì)稱的有序結(jié)構(gòu)時(shí)，就能檢測(cè)到SHG信號(hào)（即單位時(shí)間頻率倍增光的信號(hào)）。一般對(duì)稱性越低，SHG信號(hào)越強(qiáng)。除八面體和二十面體晶體外，其他所有手性晶體都會(huì)產(chǎn)生SHG信號(hào)。據(jù)估計(jì)，已知蛋白質(zhì)晶體中的99.2%均能產(chǎn)生大量的SHG信號(hào)。利用該特點(diǎn)，可以方便地檢測(cè)蛋白質(zhì)晶體。同時(shí)，由于該技術(shù)的分辨能力很強(qiáng)，在蛋白質(zhì)晶體尺寸很小的情況下（可以小至2 μm），也能檢測(cè)到明顯的信號(hào)，因此，利用該技術(shù)還可以研究蛋白質(zhì)晶體的形核過程。該技術(shù)在鑒別蛋白質(zhì)晶體與鹽晶時(shí)也具備一定的能力。由于鹽晶的對(duì)稱性通常較高，SHG信號(hào)相對(duì)較弱，而蛋白質(zhì)晶體，如一些膜蛋白晶體具有較強(qiáng)的SHG信號(hào)（如膜蛋白結(jié)晶成像中，小于5 μm膜蛋白晶體的SHG信號(hào)大于18×106counts/s，背景信號(hào)小于 1×103counts/s）[24-27]。因此，利用SHG信號(hào)強(qiáng)弱可以區(qū)分這2類晶體。

最近，雙光子顯微鏡（two-photon microscopy）也被用于膜蛋白晶體的檢測(cè)，是UV熒光和SONICC技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)應(yīng)用，能從混濁的LCP（lipidic cubic phase，脂立方相）基質(zhì)中準(zhǔn)確檢測(cè)、鑒別10 μm左右的晶體[17,28]。

依據(jù)以上評(píng)述，我們歸納總結(jié)了目前發(fā)展的高通量蛋白質(zhì)晶體鑒別技術(shù)，匯總在表1中。

3 結(jié)語

蛋白質(zhì)晶體的物理性質(zhì)是研究蛋白質(zhì)晶體特性、蛋白質(zhì)結(jié)晶過程，以及蛋白質(zhì)晶體應(yīng)用的基礎(chǔ)，是非常重要的基礎(chǔ)信息。長期以來，關(guān)于蛋白質(zhì)晶體的物理性質(zhì)雖然已有不少相關(guān)研究結(jié)果，但這些研究結(jié)果常淹沒散在于大量文獻(xiàn)中，少有人對(duì)此進(jìn)行整理總結(jié)。而在需要時(shí)，搜尋查找相關(guān)資料并不容易。針對(duì)這種問題，我們對(duì)蛋白質(zhì)晶體的密度、機(jī)械性能、聲學(xué)、熱學(xué)、光學(xué)等性質(zhì)進(jìn)行了歸納梳理；同時(shí)，面對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)踐中常見的蛋白質(zhì)晶體鑒別問題，對(duì)前人基于其物理性質(zhì)發(fā)展出的晶體鑒別方法也進(jìn)行了評(píng)述。未來蛋白質(zhì)晶體物理性質(zhì)相關(guān)方面的研究，在蛋白質(zhì)結(jié)晶方法學(xué)不斷發(fā)展的前提下，仍將繼續(xù)下去，而蛋白質(zhì)晶體鑒別技術(shù)也有望在此基礎(chǔ)上得到進(jìn)一步的發(fā)展，甚至催生出新的商業(yè)化產(chǎn)品。

[1]Steinrauf L.Preliminary X-ray data for some new crystalline forms of-lactoglobulin and hen-egg-white lysozyme[J].ActaCrystallographica,1959,12(1):77-79.

表1 高通量鑒別蛋白質(zhì)晶體的基本方法

[2]Lin H,Rosenberger F,Alexander J,et al.Convective-diffu?sive transportin protein crystalgrowth[J].JCrystGrowth,1995,151(1):153-162.

[3]Margolin A L,Navia M.A Pprotein crystals as novel catalyt?ic materials[J].Angewandte Chem Int Ed,2001,40(12):2204-2222.

[4]Vilenchik L Z,Griffith J P,St.Clair N,et al.Protein crys?tals as novel microporous materials[J].J Am Chem Soc,1998,120(18):4290-4294.

[5]Buehler M J.Mechanics of protein crystals:atomistic model?ing ofelasticityand fracture[J].JComputTheorNanosci,2006,3(5):670-683.

[6]Tait S,White E T,Litster J D.Mechanical characterization of protein crystals[J].Part Part Syst Charact,2008,25(3):266-276.

[7]Tachibana M,Kojima K,Ikuyama R,et al.Sound velocity and dynamic elastic constants of lysozyme single crystals[J].Chem Phys Lett,2000,332(3-4):259-264.

[8]Tachibana M,Koizumi H,Kojima K.Effect of intracrystalline water on longitudinal sound velocity in tetragonal hen-eggwhite lysozyme crystals[J].Phys Rev E,2004,69(5):051921-051925.

[9]Oki H,Matsuura Y,Komatsu H,et al.Refined structure of orthorhombic lysozyme crystallized at high temperature:correla?tion between morphology and intermolecular contacts[J].Acta Crystallogr D,1999,55(1):114-121.

[10]Matsuura Y,Chernov A.A morphology and the strength of in?termolecularcontactsin protein crystals[J].Acta Crystallogr D,2003,59(8):1347-1356.

[11]Kriminski S,Kazmierczak M,Thorne R.Heat transfer from protein crystals:implications for flash-cooling and X-ray beam heating[J].Acta Crystallogr D,2003,59(4):697-708.

[12]Liu J,Yang W J.Thermophysical properties of lysozyme(pro?tein)solutions[J].J Thermophys Heat Transfer,1992,6(3):531-536.

[13]Jones F T.Optical and crystallographic properties of lysozyme chloride[J].J Am Chem Soc,1946,68(5):854-857.

[14]Echalier A,Glazer R,Fulop V,et al.Assessing crystalliza?tion droplets using birefringence[J].Acta Crystallogr D,2004,60(4):696-702.

[15]Bodenstaff E R,Hoedemaeker F J,Kuil M E,et al.The pros?pects ofprotein nanocrystallography[J].Acta Crystallogr D,2002,58(11):1901-1906.

[16]Dierks K,Meyer A,Oberthur D,et al.Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wave?lengths longer than 300 nm[J].Acta Crystallogr F,2010,66(4):478-484.

[17]Madden J T,DeWalt E,Simpson G.Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection[J].Acta Crystallogr D,2011,67(10):839-846.

[18]Pusey M,Forsythe E,Achari A.Fluorescence approaches to growing macromolecule crystals[J].Methods Mol Biol,2008,426(4):377-385.

[19]Singh K A,Celie P,Rao G,et al.An approach able to es?cape the most common problem during protein crystallization ie formation of salt crystal[J/OL].Nature Precedings,http://dx.doi.org/10.1038/npre.2010.4725.1.

[20]Judge R A,SwiftK,GonzalezC.An ultravioletfluores?cence-based method for identifying and distinguishing protein crystals[J].Acta Crystallogr D,2005,61(1):60-66.

[21]Bourgeois D,Vernede X,Adam V,et al.A microspectropho?tometer for UV-visible absorption and fluorescence studies of protein crystals[J].J Appl Crystallogr,2002,35(3):319-326.

[22]Pothineni S B,Strutz T,Lamzin V S.Automated detection and centring of cryocooled protein crystals[J].Acta Crystallogr D,2006,62(11):1358-1368.

[23]Esser L,Xia D.CrysPage:a program for displaying images of crystallization trials,rapid comparisons and analysis[J].J Appl Crystallogr,2011,44(5):1130-1131.

[24]Kissick D J,Gualtieri E J,Simpson G J,et al.Nonlinear op?tical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases[J].Anal Chem,2009,82(2):491-497.

[25]Wampler R D,Kissick D J,Dehen C J,et al.Selective detec?tion of protein crystals by second harmonic microscopy[J].J Am Chem Soc,2008,130(43):14076-14077.

[26]Wanapun D,Kestur U S,Kissick D J,et al.Selective detec?tion and quantitation oforganic molecule crystallization by second harmonic generation microscopy[J].Anal Chem,2010,82(13):5425-5432.

[27]Kissick D J,Wanapun D,Simpson G J.Second-order nonlin?ear optical imaging of chiral crystals[J].Ann Rev Anal Chem,2011,4:419-437.

[28]Padayatti P,Palczewska G,Sun W,et al.Imaging of protein crystals with two-photon microscopy[J].Biochemistry,2012,51(8):1625-1637.

[29]Owen R L,Garman E.A new method for predetermining the diffraction quality of protein crystals:using SOAP as a selec?tion tool[J].Acta Crystallogr D,2005,61(2):130-140.

[30]Judge R A,SwiftK,GonzalezC.An ultravioletfluores?cence-based method for identifying and distinguishing protein crystals[J].Acta Crystallogr D,2004,61(1):60-66.

[31]Forsythe E,Achari A,Pusey M L.Trace fluorescent labeling for high-throughput crystallography[J]. Acta Crystallogr D,2006,62(3):339-346.

[32]Groves M R,Muller I B,Kreplin X,et al.A method for the general identification of protein crystals in crystallization exper?iments using a noncovalent fluorescent dye[J].Acta Crystal?logr D,2007,63(4):526-535.

[33]Gill H S.Evaluating the efficacy of tryptophan fluorescence and absorbance as a selection tool for identifying protein crys?tals[J].Acta Crystallogr F,2010,66(3):364-372.