趙彩亮 ，蘭晶 ，貝祝春 ，楊恒林

1.大理學(xué)院 病原與媒介生物研究所，云南 大理 671003；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，北京 100071；3.云南省寄生蟲病防治所，云南瘧疾研究中心，云南 普洱 665000

瘧疾是由瘧原蟲感染引起的蟲媒傳染病，是目前全球最受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一。全球每年約2.47億人罹患瘧疾，近100萬人死于瘧疾[1]，嬰兒、5歲以下兒童及孕婦是主要受威脅人群[2]。感染人類的瘧原蟲主要有間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）、三日瘧原蟲（P.malariae）、惡性瘧原蟲（P.falciparum）和卵形瘧原蟲（P.ovale），其中以惡性瘧原蟲感染引起的惡性瘧最為嚴(yán)重，是每年近百萬人死于瘧疾的罪魁禍?zhǔn)住?/p>

經(jīng)過大量努力，瘧疾在我國及歐美等發(fā)達(dá)國家已得到有效控制，但在非洲及東南亞部分國家仍廣泛流行。20世紀(jì)60年代以來，惡性瘧原蟲對氯喹、磺胺多辛-乙胺嘧啶等廣泛應(yīng)用的抗瘧藥相繼產(chǎn)生抗藥性，全球瘧疾的發(fā)病率和死亡率有所回升[3-4]。瘧原蟲抗藥性的出現(xiàn)和快速傳播，使得除青蒿素類藥物之外的現(xiàn)有抗瘧藥普遍存在抗藥性問題[5-6]，且有研究表明已產(chǎn)生抗性的瘧原蟲株可更快地對新抗瘧藥產(chǎn)生抗藥性[7]。為了應(yīng)對日益嚴(yán)重的抗藥性問題，遏制瘧原蟲抗藥性的發(fā)展，世界衛(wèi)生組織推薦以基于青蒿素類藥物的復(fù)方療法（artemisinin-based combination therapies，ACT）為無并發(fā)癥性惡性瘧的一線治療方案，ACT已成為全球瘧疾防控惡性瘧的主要手段[8]。然而，隨著某些地區(qū)惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物敏感性的日漸降低[9]，使得這一目前惟一普遍有效的抗瘧藥也同樣面臨著瘧原蟲抗藥性的危險。因此，尋找新的抗瘧藥，特別是與現(xiàn)有抗瘧藥靶點不同的新型抗瘧藥受到了越來越多的關(guān)注[2,5]。

近年來，有關(guān)學(xué)術(shù)和科研機(jī)構(gòu)的支持推動了抗瘧新藥的研究[5,10-11]，數(shù)種新的ACT已進(jìn)入后期臨床試驗階段，一些新抗瘧藥，如全合成的三惡烷類新藥Rbx11160和OZ439、葛蘭素史克研發(fā)的吡啶酮類新藥GSK932121和默克授權(quán)MMV研發(fā)的MK4815也進(jìn)入臨床研究。惡性瘧原蟲基因組測序的完成，為尋找新的抗瘧分子靶標(biāo)帶來了便利[12]。但已有研究所發(fā)現(xiàn)、鑒定的瘧原蟲必需或可藥化（druggable）新靶點，卻鮮有得到有效化合物的驗證。阿托喹酮的作用靶點，線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈細(xì)胞色素bc1復(fù)合物的確證是臨床有效抑制劑靶點發(fā)現(xiàn)的最近范例[13-16]。

許多臨床使用的抗瘧藥通過直接或間接影響嘧啶代謝而發(fā)揮作用，如二氫葉酸還原酶或二氫葉酸合成酶抑制劑（如乙胺嘧啶、氯胍、磺胺類藥物）阻斷胸腺嘧啶合成所必需的葉酸的代謝[17]。阿托喹酮的作用靶點是線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈中的細(xì)胞色素bc1復(fù)合物，但阿托喹酮治療導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)UTP和CTP水平下降的發(fā)現(xiàn)[18-19]，以及細(xì)胞色素bc1復(fù)合物活性對于為二氫乳清酸脫氫酶（dihydroorotate dehydroge?nase，DHODH）提供合成嘧啶所需氧化型輔酶Q的必需性[20-21]，表明它同樣通過阻斷嘧啶代謝發(fā)揮抗瘧作用。胸苷酸合成酶抑制劑雖未被用于臨床，但也被證明有較強(qiáng)的抗瘧作用[22-26]。上述研究表明，嘧啶生物合成途徑是抗瘧藥發(fā)現(xiàn)的一個重要源泉。在此，我們簡要綜述近年來以惡性瘧原蟲嘧啶從頭合成途徑中第四個酶——DHODH為對象的抗瘧新靶點及新藥發(fā)現(xiàn)研究。

1 嘧啶從頭合成途徑為瘧原蟲所必需

作為DNA和RNA生物合成的前體，嘧啶是細(xì)胞生命所必需的代謝產(chǎn)物[21]。細(xì)胞可以氨、碳酸氫鹽、左旋天冬氨酸為原料從頭合成所需的嘧啶（從頭合成途徑），也可利用現(xiàn)成的嘧啶堿基或核苷酸（補(bǔ)救途徑）。瘧原蟲較為特殊，它缺乏利用現(xiàn)成嘧啶的酶，從頭合成途徑是其獲得細(xì)胞生長所需嘧啶的惟一來源。

瘧原蟲首先需要通過6個酶催化的生化反應(yīng)合成UMP，后者進(jìn)一步被用于ATP、CTP、cTMP及后續(xù)其他細(xì)胞生長所需的核苷酸代謝產(chǎn)物的合成。這6個酶分別為谷酰轉(zhuǎn)氨-氨甲酰磷酸合成雙功能酶（GAT/CPS）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ACT）、二氫乳清酸酶（DHOtase）、二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）、乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（OPRT）和乳清苷5'-單磷酸脫羧酶（OMPDC）。這些酶的存在已在瘧原蟲提取物酶活性的檢測中得到證實[26-27]，它們各自的編碼基因也已在瘧原蟲基因組中得到鑒定[12]。其中，DHODH已從惡性瘧原蟲的線粒體中分離得到[28]，而其基因序列在瘧原蟲基因組測序完成前就已被報道[29]。

瘧原蟲嘧啶補(bǔ)救途徑的缺失最初是在核酸放射性標(biāo)記前體摻入分析研究中發(fā)現(xiàn)的[30]。研究發(fā)現(xiàn)，乳清酸是惟一一種可被瘧原蟲利用的嘧啶合成前體。而后，5-氟乳清酸具有較強(qiáng)抗瘧作用、5-氟尿嘧啶無抗瘧作用的發(fā)現(xiàn)為此提供了佐證[23-24]。已完成的瘧原蟲基因組測序數(shù)據(jù)中無嘧啶補(bǔ)救途徑相關(guān)基因的序列信息進(jìn)一步證實這一點[12]。由于缺乏可利用現(xiàn)成嘧啶與核苷酸的補(bǔ)救途徑，嘧啶從頭合成途徑中的所有酶都被認(rèn)為是瘧原蟲所必需的。然而，要成為有價值的抗瘧藥靶點，除了應(yīng)是瘧原蟲所必需的之外，還須滿足以下幾個條件：靶蛋白可以與類藥小分子以高親和力結(jié)合，即靶蛋白“可藥化”；靶抑制劑能抑制細(xì)胞生長；抑制劑對瘧原蟲和宿主細(xì)胞有較高的選擇性。如下所述，瘧原蟲DHODH可滿足這些條件，因此被認(rèn)為是理想的抗瘧藥新靶點。

2 惡性瘧原蟲DHODH是理想的抗瘧藥新靶點

DHODH屬于一類帶有β/α桶狀結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)超家族[31]。不同物種中的DHODH有Ⅰ型（位于細(xì)胞漿，如細(xì)菌）和Ⅱ型（位于線粒體內(nèi)膜或細(xì)胞膜）2種存在類型。惡性瘧原蟲DHODH（PfDHODH）和人DHODH同為Ⅱ型線粒體酶，人DHODH作為藥物靶點的有效性已得到臨床驗證，以此為靶點的萊氟米特（Leflunomide）已獲準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[32]，布奎那（Brequinar）（圖1）也作為抗腫瘤藥進(jìn)入了臨床研究[33]。這為同為線粒體型酶的PfDHODH作為藥物靶點的可行性提供了“可藥化”數(shù)據(jù)支持。

在嘧啶從頭合成中，DHODH以黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）依賴的氧化-還原反應(yīng)催化二氫乳清酸形成乳清酸，這需要2步催化反應(yīng)來完成：①FMN還原驅(qū)動的二氫乳清酸氧化；②通過還原型黃素單核苷酸（FMNH2）的再氧化使酶重新活化。FMN氧化-還原循環(huán)所需的輔助因子因酶類型和細(xì)胞定位的不同而有所不同。Ⅰ型胞漿酶須利用富馬酸或NAD+，Ⅱ型線粒體酶則通過利用氧化型輔酶Q而與線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈偶合[20]。最近，Vaidya等[21-22]驗證了瘧原蟲嘧啶從頭合成與線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈間的這種密切聯(lián)系。通過重組表達(dá)富馬酸依賴的胞漿型酵母DHODH，惡性瘧原蟲可繞過對自身線粒體型酶的依賴，從而表現(xiàn)出阿托喹酮抗性。這表明至少就瘧原蟲的體外生長而言，細(xì)胞色素bc1復(fù)合物的主要功能是為DHODH催化產(chǎn)生乳清酸提供氧化型輔酶Q，從而證明了DHODH是瘧原蟲所必需的，且通過干擾DHODH催化的生化反應(yīng)可抑制瘧原蟲的生長，如阿托喹酮。

一些對人DHODH有較強(qiáng)抑制作用的抑制劑對PfDHODH并無抑制活性，這為DHODH抑制劑的選擇性作用提供了線索[34]。隨后的X線衍射結(jié)構(gòu)分析表明，雖然A77 1726（萊氟米特的活性代謝物，圖1）與PfDHODH和人DHODH結(jié)合于相同的口袋狀結(jié)構(gòu)，但二者與抑制劑結(jié)合的氨基酸殘基并不具有保守性[35]。因此，尋找具有選擇性作用的DHODH抑制劑是切實可行的。此外，嘧啶補(bǔ)救途徑的缺失使瘧原蟲完全依賴于DHODH參與的嘧啶從頭合成途徑，進(jìn)而對DHODH抑制劑敏感，而人類細(xì)胞卻可通過嘧啶補(bǔ)救途徑獲取維持細(xì)胞生長所需的嘧啶。這也使DHODH抑制劑具有較高的選擇性。

正如上所述，PfDHODH作為理想的抗瘧藥發(fā)現(xiàn)新靶點受到了越來越多的關(guān)注。高通量篩選（high-throughput screening，HTS）、已 知 DHODH 抑制劑的藥物化學(xué)研究和基于酶-配體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)解析研究等相繼被用于PfDHODH選擇性抑制劑的篩選、鑒定。其中，HTS取得了較大的成功。

3 PfDHODH抑制劑的高通量篩選研究

2005年，美國德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心Phillips領(lǐng)導(dǎo)的研究小組首次報道了PfDHODH抑制劑HTS研究[34]。他們建立了基于二氯靛酚（dichloroindophe?nol，DCIP）還原染色法的PfDHODH抑制劑HTS方法，并對220 000個化合物進(jìn)行了篩選。以3 μmol/L的單濃度樣品進(jìn)行篩選，獲得了1249個命中化合物（抑制率＞60%），命中率達(dá)0.6%。相同濃度的人DHODH抑制活性測定表明，幾乎所有的命中物都表現(xiàn)出對PfDHODH的選擇性抑制作用。初步的量效關(guān)系測定表明，其中IC50＜0.6 μmol/L的包括苯基苯甲酰胺類（phenylbenzamides）、尿素類（ureas）、萘甲酰胺類化合物（naphthamides）和三唑并嘧啶（trizolo?pyrimidine）系列化合物（圖2，a～d）。其中，前3類是命中物中最常見的化合物類型，其對PfDHODH的IC50為0.02～0.8 μmol/L，且比對人DHODH的抑制活性高70～12 500倍，但對體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲并無抑制作用，因此未得到進(jìn)一步的研究。之后，哈佛大學(xué)的Clardy等對含208 000個結(jié)構(gòu)樣本的小分子化合物進(jìn)行了PfDHODH抑制活性的HTS研究[36]。同樣用基于DCIP還原染色的方法，以10 μmol/L的單濃度樣本進(jìn)行篩選，命中率達(dá)0.3%，其中55個命中化合物IC50在1 μmol/L以下，5類化合物結(jié)構(gòu)在體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲試驗中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗瘧作用，并具有良好的作用選擇性。其中活性最強(qiáng)的為噻吩類化合物（圖2，e；PfDHODH IC50=40 nmol/L），但進(jìn)一步的系列化合物合成與初步構(gòu)效關(guān)系研究并未發(fā)現(xiàn)活性更強(qiáng)的類似物。

4 基于人DHODH抑制劑的藥物化學(xué)研究

英國利茲大學(xué)的一個研究小組對一系列布奎那的衍生物進(jìn)行了探索研究。布奎那對PfDHODH的活性極低（IC50＞500 μmol/L），其衍生物中活性最強(qiáng)的也只達(dá)到中等活性（IC50=40 μmol/L），且作用選擇性不高[37]。他們以A77 1726結(jié)構(gòu)骨架為模型，設(shè)計、合成高效、選擇性PfDHODH抑制劑的嘗試也同樣未獲得成功[38-40]。最終，他們以四環(huán)胺為起點獲得了一系列活性達(dá)亞微摩爾級別（IC50=0.2～0.4 μmol/L）且對PfDHODH具有較高選擇性（200～1200倍）的衍生物。其中活性最強(qiáng)的體外抗惡性瘧原蟲3D7的EC50為 2 μmol/L（圖2，f）。

圖1 人DHODH抑制劑

5 三唑并嘧啶類PfDHODH抑制劑的研究

Phillips等[36]發(fā)現(xiàn)三唑并嘧啶類化合物DSM1（圖2，d）具有較高的作用選擇性，且在體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲試驗中同樣具有較強(qiáng)活性（IC50PfDHODH=0.047 μmol/L；IC50人 DHODH＞200 μmol/L；EC50惡性瘧原蟲3D7=0.079 μmol/L)。在此基礎(chǔ)上，他們建立了一個簡單、廉價的三步合成路線，合成若干DSM1類似物，并開展了進(jìn)一步的研究。他們的研究為PfDHODH抑制劑的抗瘧研究及PfDHODH靶向抗瘧新藥的深入研究提供了大量有用的信息。

5.1 構(gòu)效關(guān)系研究

結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系（SAR）研究數(shù)據(jù)表明[41-43]：①無取代的橋氮N1是化合物活性所必需的；②在萘基環(huán)引入雜原子導(dǎo)致化合物活性降低；③可用大芳香環(huán)或疏水環(huán)系統(tǒng)，如蒽、取代苯環(huán)等替化合物結(jié)構(gòu)中的萘基；④替代萘基的取代苯環(huán)其取代位置只能是對位（CF3＞Br＞Cl＞Me＞F），鄰位取代導(dǎo)致活性的完成喪失；⑤C6位的乙基或三氟甲基取代和C2位的甲基取代導(dǎo)致化合物活性降低。而且，這一系列化合物的酶抑制活性與其體外抗瘧活性存在較好的相關(guān)性。這說明DHODH是它們發(fā)揮抗瘧作用的細(xì)胞靶點。

5.2 X線衍射晶體結(jié)構(gòu)研究

圖2 PfDHODH抑制劑［IC50（μmol/L），PfDHODH vs人DHODH］

圖3 PfDHODH及人DHODH的X線衍射晶體結(jié)構(gòu)

PfDHODH與三唑并嘧啶類系列化合物結(jié)合復(fù)合物的X線衍射結(jié)構(gòu)解析研究提供了小分子與PfDHODH選擇性結(jié)合的結(jié)構(gòu)信息[42]。首先，PfDHODH與三唑并嘧啶系列抑制劑的結(jié)合位點由2部分組成（圖3），一個與萘基、蒽基或三氟甲基-苯基結(jié)合的完全疏水位點和能與三唑并嘧啶形成氫鍵相互作用的口袋狀結(jié)構(gòu)。萘基與2個苯丙氨酸殘基（Phe227和Phe188）通過π鍵之間的堆積力相互作用，橋氮N1和三唑并嘧啶環(huán)分別與His185和Arg265形成氫鍵相互作用。其中，三唑并嘧啶基團(tuán)的位置與A77 1726與PfDHODH結(jié)合的β-羥基烯胺部分重疊[35]。但萘基的結(jié)合位點是通過Phe188的旋轉(zhuǎn)形成的一個新的口袋狀結(jié)構(gòu)。這解釋了為何PfDHODH能與多種結(jié)構(gòu)類型化合物以高親和力結(jié)合。其次，三唑并嘧啶類化合物與PfDHODH結(jié)合的某些關(guān)鍵氨基酸殘基在不同物種間并不具保守性，與人DHODH結(jié)合抑制劑的殘基位點也不相同（圖3）。如在接近疏水口袋處，A77 1726的三氟甲基苯基結(jié)合于人DHODH的Ala59、Gly363和Pro364，而三唑并嘧啶類化合物的萘基與PfDHODH的Phe188和Met536形成相互作用，且因Phe188的旋轉(zhuǎn)與Leu189和Leu197形成一個新的萘基結(jié)合口袋。這為三唑并嘧啶類化合物對PfDHODH的選擇性結(jié)合提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外，配體結(jié)合DHODH與小分子的晶體結(jié)構(gòu)比較顯示橋氮N1的強(qiáng)斥電子作用使三唑并嘧啶環(huán)電荷分布偏移而更利于與相應(yīng)氨基酸殘基發(fā)生穩(wěn)定的氫鍵相互作用。以不能形成上述分子內(nèi)電荷偏移的O或S取代N1使化合物活性喪失，及His185或Arg265突變?yōu)锳la后DHODH與抑制劑的結(jié)合力降低，說明這種穩(wěn)定氫鍵相互作用對于三唑并嘧啶類化合物的活性至關(guān)重要。最后，從三唑并嘧啶環(huán)至FMN結(jié)合位置之間存在一個狹窄的溝狀結(jié)構(gòu)空間，提示先導(dǎo)化合物的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化也許可利用這一結(jié)構(gòu)空間的特征。

5.3 體內(nèi)抗瘧作用的研究

以標(biāo)準(zhǔn)鼠瘧模型進(jìn)行的體內(nèi)抗瘧研究發(fā)現(xiàn)，原始的HTS命中化合物DSM1雖然在細(xì)胞試驗中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗瘧作用，對伯氏瘧原蟲（P.berghei）感染卻無抑制作用。藥代動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)多次給藥可導(dǎo)致血藥濃度的顯著下降，提示DSM1可能是一個代謝誘導(dǎo)物。這被認(rèn)為是其在動物模型中無效的原因。此外，部分三唑并嘧啶系列化合物對惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲DHODH抑制活性的差異也被認(rèn)為是其在動物模型中無效的可能原因?；诖耍琍hil?lips等[43]進(jìn)行了進(jìn)一步的交互式先導(dǎo)化合物優(yōu)化研究，以不同的取代苯環(huán)替換萘基，合成系列類似物，并用人肝臟微粒體模型測試其代謝穩(wěn)定性。最終，他們獲得了一個代謝穩(wěn)定，且在鼠瘧模型中具有顯著抗瘧作用的三唑并嘧啶類化合物DSM74（圖2：g）。在以伯氏瘧原蟲感染小鼠模型進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)4 d抑制試驗中，DSM74 50 mg/kg每天2次和每天1次的抑制率分別達(dá)到了95%和71%，且具有良好的耐受性無明顯的毒副作用。

這些數(shù)據(jù)表明PfDHODH抑制劑在體內(nèi)可有效發(fā)揮作用并抑制瘧原蟲血癥，進(jìn)一步確證了PfDHODH作為抗瘧新藥發(fā)現(xiàn)靶點的有效性。

6 結(jié)語

嘧啶補(bǔ)救途徑的缺失使瘧原蟲對嘧啶從頭合成途徑靶向抑制劑生物高度敏感。DHODH催化嘧啶從頭合成途徑的第四步反應(yīng)，其作為瘧原蟲必需的酶和可藥化靶點已得到了遺傳學(xué)和化學(xué)研究的證實。PfDHODH作為抗瘧藥發(fā)現(xiàn)的新靶點受到了越來越多的關(guān)注，其中HTS作為PfDHODH抑制劑篩選、鑒定的有效策略已取得了很大的成功。X線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析的研究為PfDHODH選擇性抑制劑的鑒定、設(shè)計提供了結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)，并為先導(dǎo)化合物的進(jìn)一步優(yōu)化提供了大量有價值的信息。三唑并嘧啶系列化合物已經(jīng)從命中化合物階段進(jìn)入了早期先導(dǎo)物優(yōu)化研究階段，并已獲得了具有良好代謝穩(wěn)定性和體內(nèi)抗瘧活性的類似物。綜上所述，PfDHODH是一個有前景的抗瘧新藥研究靶點，PfDHODH抑制劑研究的成功將為臨床提供與現(xiàn)有抗瘧藥全然不同的新型抗瘧藥。

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