楊 娟，馬小偉，章宏瓊，周 云，宋佳楠，朱憶思夢，張洪勤，施孟如

(1. 杭州師范大學發(fā)育與再生研究所，浙江 杭州 310036;2. 溫州醫(yī)科大學仁濟學院，浙江 溫州 325035;3. 溫州醫(yī)科大學生物學實驗教學中心，浙江 溫州 325035)

溫度對相同引種地三個秋茄居群遺傳多樣性的影響

楊 娟1，馬小偉2，章宏瓊2，周 云2，宋佳楠2，朱憶思夢2，張洪勤2，施孟如3

(1. 杭州師范大學發(fā)育與再生研究所，浙江 杭州 310036;2. 溫州醫(yī)科大學仁濟學院，浙江 溫州 325035;3. 溫州醫(yī)科大學生物學實驗教學中心，浙江 溫州 325035)

秋茄是世界分布最北的紅樹植物，研究溫度對其遺傳多樣性的影響有助于闡明其抗凍機制.文章同時應用RAPD和ISSR分子標記技術，對3個不同緯度地區(qū)秋茄居群的遺傳多樣性和遺傳分化進行分析，根據(jù)RAPD 和 ISSR 數(shù)據(jù)計算遺傳距離并進行聚類分析.2種方法均顯示3個居群分為2大支：西門島和象山港兩居群之間遺傳距離最小，兩者之間的遺傳一致度最大，首先聚為一類；漳江口和象山港居群之間的遺傳距離最大，兩者之間的遺傳一致度最小，因此單獨為一支.由于溫度的原因對引種的秋茄進行了篩選，導致遺傳多樣性減少.

秋茄；RAPD；ISSR；遺傳多樣性

紅樹林是處于亞熱帶、熱帶海洋與陸地過渡帶的特殊生態(tài)系統(tǒng)，是海岸帶的生態(tài)關鍵區(qū)，具有抵抗海嘯和臺風、調節(jié)區(qū)域氣候、維護生物多樣性等重要生態(tài)功能[1].秋茄(Kandeliacandel)是中國分布最廣的常見紅樹植物，其天然分布最北至福建福鼎市，人工種植最北至寧波象山港，全世界最北分布的紅樹植物也是秋茄[2].國內(nèi)外學者對秋茄在生態(tài)學[3-4]、生理學[5-6]、生物化學[7]、藥物學[8]、耐鹽機理[9]、分子[10]等多個方面開展了大量研究.林盛昌等[11]采用月最低溫度這一指標，以溫差2 ℃ 劃分，并結合野外考察資料，把中國紅樹植物分為7個耐寒等級序列，其中秋茄自然分布緯度最高，具有極強的適應能力，為最耐寒的種類.但向高緯度移植時經(jīng)常發(fā)生的極端低溫對其成功越冬產(chǎn)生了威脅[12].對此，各有關國家開展了各方面研究，但大多集中在生物化學、生態(tài)學、生理學[13]等領域, 而關于分子生物學的研究也十分必要.

本研究選擇秋茄作為研究對象，采用隨機擴增多態(tài)性 (Randomly amplified polymorphism DNA,RAPD)和簡單序列重復間區(qū)(inter-simple sequence repeat,ISSR)分子標記技術，探討溫度對來源于同一地區(qū)3個秋茄居群的遺傳多樣性和遺傳分化的影響,為高緯度選育抗凍秋茄品種提供技術理論基礎.

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

秋茄葉片采自廈門漳江口、溫州西門島和寧波象山港(表1).在選定的3個不同緯度居群中每隔 5～10 m選擇長勢良好的植株，每樹采集當年生的展開完全的幼嫩葉片(倒二葉)10片，用棉花蘸取足夠的水分包住莖枝條的基部，保持葉片新鮮不變質，迅速放冰上保存，處理待測，并于-20 ℃冰箱內(nèi)保存.

表1 取樣地基本情況Tab. 1 Basic information of sample area

1.2 主要實驗儀器及試劑

NANODROP 2000為Thormal公司產(chǎn)品；Gel Doc電泳凝膠成像系統(tǒng)，DTC200PCR儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；UV 2800紫外可見分光光度計為上海尤尼柯公司產(chǎn)品；5417R低溫離心機為Eppendorf產(chǎn)品.

ISSR引物、RAPD引物、1 Kbp DNA Ladder Marker購自上海捷瑞生物公司，Taq酶購自大連寶生物.

1.3 方法

秋茄葉片總DNA采用改良后的CTAB法[14]提取，獲得的DNA 由NANODROP 2000測定其濃度及純度.根據(jù)基因組 DNA 濃度值將樣品稀釋至20 ng/μL 用于RAPD和ISSR分析.

表2 RAPD和ISSR引物序列和最佳退火溫度Tab. 2 Primers and annealing temperature screened for RAPD and ISSRamplification

RAPD-PCR反應對15個RAPD引物進行篩選，從中選取8個擴增條帶清晰、重復性穩(wěn)定的引物用于RAPD-PCR的擴增(表2).擴增體系為每25 μL反應體積含：2.5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)、2.0 μL dNTP mixture(2.5 mmol/L)、1.5 μL MgCl2(25 mmol/L)、2.0 μL prime(10 μmol/L)，1.0 μL DNA(30～50 ng)，1.5 μL TaKaRa Taq(5 U/μL)，加ddH2O至25 μL，用漩渦混合器對所加的各組分進行混合；擴增程序：94 ℃預變性5 min，之后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性1 min、36 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，最后于72 ℃再延伸7 min.將擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

ISSR-PCR反應對15個ISSR引物進行了篩選，從中選取9個擴增條帶清晰、重復性較好的引物用于PCR擴增(表2).擴增體系為每25 μL反應體積含：2.5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)、2.0 μL dNTP mixture(2.5 mmol/L)、1.5 μL MgCl2(25 mmol/L)、2.0 μL prime(10 μmol/L)，1.0 μL DNA(30～50 ng)，1 U TaKaRa Taq(5 U/μL)，加ddH2O至25 μL；擴增程序：94 ℃預變性5 min，之后進行45個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性45 s、52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，最后于72 ℃再延伸7 min.將擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

重復擴增和電泳2次，選取清晰的條帶進行統(tǒng)計分析.電泳圖譜的每條帶DNA片段均為1個分子標記代表1個引物的結合位點，根據(jù)分子標記的遷移率及有無來統(tǒng)計所有的二元數(shù)據(jù).有帶顯性記為“1”， 無帶隱性記為“0”. PopGen32軟件計算各數(shù)據(jù)，并根據(jù)Nei’s遺傳距離進行UPGMA聚類分析，構建系統(tǒng)樹.

2 實驗結果

2.1 不同緯度秋茄居群的遺傳多樣性

2.1.1 RAPD實驗結果的分析

Marker：100 bp Plus DNA Ladder；泳道1～8：象山港居群8株不同秋茄樣品；泳道9～16：西門島居群8株不同秋茄樣品；泳道17～24：漳江口居群8株不同秋茄樣品.圖1 RAPD引物S58的擴增結果Fig. 1 RAPD-PCR results of primer S58

用篩選出的8個RAPD隨機引物在3個緯度秋茄居群24個個體間擴增，得到的條帶為0.3 ～3 kb.共擴增出1 152個條帶，多態(tài)性條帶為 30條，圖1為引物S58的擴增結果.根據(jù)RAPD擴增結果計算，3個居群的多態(tài)位點百分率在17.46%～53.97%，平均值為39.15%(表3).每個位點的平均等位基因數(shù)為1.346 1±0.460 0.Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)是衡量群體遺傳多樣性的指標.3個居群的H指數(shù)為0.075 8 ～ 0.226 5，總基因多樣度(Ht)和居群內(nèi)基因多樣度(Hs)分別為0.255 6和0.166 8.計算基因分化系數(shù)(Gst)為0.347 4，其中居群間的遺傳變異占總的遺傳變異的34.74%，居群內(nèi)的遺傳變異占總變異的65.26%，表明居群內(nèi)存在較高的遺傳分化.3個居群之間的基因流(Nm)為1.276 6，表明溫秋茄居群間的基因交流較高.3個居群的Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.108 7～0.327 6，平均值為0.290 9，居群間的I指數(shù)為0.328 1(表3).3個居群中，漳江口居群表現(xiàn)出相對較高的遺傳多樣性，象山港居群和西門島居群表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性.

表3 RAPD標記的秋茄3個居群的遺傳多樣性Tab. 3 Genetic variations in three populations of Kandelia candel by RAPD

2.1.2 ISSR實驗結果的分析

Marker：100 bp Plus DNA Ladder；泳道1～8：象山港居群8株不同秋茄樣品；泳道9～16：西門島居群8株不同秋茄樣品；泳道17～24：漳江口居群8株不同秋茄樣品.圖2 ISSR引物BW09481HAP的擴增結果Fig. 2 ISSR-PCR results of primer BW09481HAP

9個ISSR隨機引物擴增3個秋茄居群共24個個體.擴增的條帶為0.15～2.2 kb，共擴增出1 368個條帶，多態(tài)性條帶為22條.圖2為引物BW09481HAP擴增結果.3個居群的多態(tài)位點百分率為29.82%～54.39%，平均值為41.52%(表4).每個位點的平均等位基因數(shù)為1.415 2±0.444 4.本實驗中，3個居群的H指數(shù)為0.096 2～0.245 3，總基因多樣度和居群內(nèi)基因多樣度分別為0.230 0和0.171 7.基因分化系數(shù)為0.253 5，其中居群間的遺傳變異占總遺傳變異的25.35%，居群內(nèi)的遺傳變異占總變異的74.65%，表明居群內(nèi)存在較高的遺傳分化.3個居群之間的基因流為1.622 8，表明溫秋茄居群間的基因交流較高.3個居群的I指數(shù)為0.145 0～0.347 4，平均值為0.247 2，居群間的I指數(shù)為0.349 5.3個居群中，漳江口居群表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，象山港居群和西門島居群表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性，此結果與RAPD實驗結果一致.

表4 ISSR標記的秋茄3個居群的遺傳多樣性Tab. 4 Genetic variation in three populations of Kandelia candel by ISSR

2.2 遺傳相似性分析

表5 RAPD標記的秋茄居群間的Nei’s無偏差遺傳距離(對角線以下)及遺傳相似系數(shù)(對角線以上)Tab. 5 Nei’s genetic distance(below diagonal) and geneticidentity(above diagonal) by RAPD

遺傳分化指數(shù)只能對居群分化的程度作出評價，卻不能判定居群間相互關系的遠近，而遺傳相似系數(shù)和遺傳距離的度量則可以說明每個居群間彼此關系的遠近.用popgene32軟件分析RAPD與ISSR實驗結果，計算秋茄居群間的Nei’s無偏差遺傳距離(D)和遺傳一致度.

圖3 RAPD標記的秋茄居群間Nei’s無偏差的UPGMA 聚類圖Fig. 3 Nei’s Unbiased Measures of Biosystematic dengrogram of Kandelia candel populations by RAPD

表5為根據(jù)RAPD結果計算所得秋茄居群間的Nei’s無偏差遺傳距離(D)和遺傳一致度.結果顯示：3個秋茄居群間的Nei’s無偏差遺傳距離在0.014 6～0.140 8；其中西門島和象山港兩居群之間遺傳距離最小(0.014 6)，兩者之間的遺傳一致度最大(0.985 5)；漳江口和西門島之間的遺傳距離最大(0.140 8 )，兩者之間的遺傳一致度最小(0.868 6).依據(jù)Nei’s的遺傳距離對不同居群進行UPGMA 聚類，分析結果(圖3)表明：3個居群分為2大支，象山港與西門島兩個居群的遺傳距離最小，首先聚為一類；漳江口居群與其它居群遺傳距離最遠，單獨為一支.

ISSR結果用popgene32軟件計算秋茄居群間的Nei’s無偏差遺傳距離(D)和遺傳一致度.由表6結果可知： 3個秋茄居群間的Nei’s無偏差遺傳距離在0.069 3～0.137 3；其中西門島和象山港兩居群之間遺傳距離最小(0.069 3)，兩者之間的遺傳一致度最大(0.933 1)；漳江口和象山港之間的遺傳距離最大(0.137 3)，兩者之間的遺傳一致度最小(0.871 7).依據(jù)Nei’s的遺傳距離對不同居群進行UPGMA聚類分析，結果表明：3個居群分為2大支，象山港與西門島兩個居群的遺傳距離最小，首先聚為一類；漳江口居群與其它居群遺傳距離最遠，單獨為一支(圖4).

表6 ISSR標記的秋茄居群間的Nei’s無偏差遺傳距離(對角線以下)及遺傳相似系數(shù)(對角線以上)

圖4 ISSR標記的不同緯度秋茄居群間Nei’s無偏差的UPGMA 聚類圖Fig. 4 Nei’s Unbiased Measures of Biosystematic dengrogram of Kandelia candel populations by ISSR

3 討 論

遺傳多樣性的產(chǎn)生是由于遺傳信息在外界或內(nèi)在因素作用下，在復制過程中出現(xiàn)差錯(如DNA片段的缺失、倒位、轉座或易位等)，從而導致了各種不同的遺傳變異.植物居群遺傳變異的分布與該物種的地理分布情形、 生態(tài)特征有關[15]，植物群體遺傳多樣性水平表明了一個物種在特定環(huán)境中基因的豐富程度，是物種適應環(huán)境和遺傳進化的基礎.

物種的遺傳多樣性水平可以為其現(xiàn)狀和保護價值的評估以及遷地保護提供非常重要的信息.本實驗結果表明3個居群內(nèi)存在較高的遺傳分化.而居群的遺傳結構從一定意義上說是基因流和遺傳漂變兩種力量相互作用的結果.居群間存在的基因流的強弱對群體遺傳分化具有重要影響，當Nm>1時，基因流能發(fā)揮其均質化作用，可防止由遺傳漂變引起的居群間的遺傳分化；如果Nm<1，基因流成為遺傳分化的主要原因，低水平的基因流可能造成群體對局部生態(tài)環(huán)境的適應，進而促使群體間的遺傳隔離，導致種群間明顯的遺傳分化.植物居群間的基因流是借助于花粉、種子、孢子、植株個體以及其他攜帶遺傳物質的物體為媒介進行的，其中花粉和種子擴散是自然植物種群最主要的基因流.而地理隔離是阻止花粉和種子擴散等基因流的最主要因素.本研究中居群間的Nm均遠大于1，可能是不同居群地理間隔不大，尤其是西門島居群與象山港居群從漳江口居群引種，所以不同居群間發(fā)生基因交流的頻率較高.加上本實驗采樣地的限制，從而造成種群間的分異不明顯.

多態(tài)位點百分率可以作為遺傳多樣性高低的指標[16].本研究RAPD和ISSR分析結果均顯示, 3個居群的多態(tài)位點百分率依次為漳江口居群>西門島居群>象山港居群，表明3個居群中，漳江口居群具有較高的遺傳多樣度.秋茄基因組的多樣性是其廣泛適應性的決定因素，許多研究表明，低溫是限制紅樹植物向高緯度分布的重要因子[17]，秋茄在高緯度引種過程中，主要的環(huán)境制約因子是溫度，特別是最低月均溫.而本研究所采用的西門島及象山港秋茄樣品均由漳江口引種，由于三地緯度及平均溫度等自然環(huán)境條件差異較大，其居群經(jīng)自然選擇，不適應低溫秋茄植株被淘汰，而適應低溫的秋茄保留下來并產(chǎn)生了相應的適應性.聚類分析結果表明：3個居群分為2大支，西門島和象山港兩居群首先聚為一類；漳江口居群單獨為一支.實驗結果符合3個秋茄居群的地理分布.

本研究結果表明，向更高緯度地區(qū)引種紅樹植物時可選擇與抗凍秋茄遺傳關系和生理特性接近的樹種.由于溫度的影響，同地引種的秋茄在遺傳多樣性上已經(jīng)發(fā)生了一定的變化，生產(chǎn)在溫度較低地方的秋茄居群遺傳多樣性更小，但同時為低緯度引種篩選出有著優(yōu)良遺傳基因的品種.

[1] Nagelkerken I, Blaber S J M, Bouillon S,etal. The habitat function of mangroves for terrestrial and marine fauna: a review[J]. Aquatic Botany，2008,89(2):155-185.

[2] 仇建標,黃麗,陳少波，等.強潮差海域秋茄生長的宜林臨界線[J].應用生態(tài)學報,2010,21(5):1252-1257.

[3] Chen G Z, Mao S Y, Tame N F Y，etal. Effect of synthetic wastewater on youngKandeliacandelplants growing under greenhouse conditions[J]. Hydrobiologia，1995,295:263-273.

[4] Bandaranayake W M. Traditional and medicinal uses of mangroves[J]. Mangroves and Salt Marshes,1998,2(3):133-148.

[5] 王文卿，林鵬.紅樹植物體內(nèi)元素分布特點與抗鹽機理[J].林業(yè)科學，2003，39(4):30-36.

[6] 葉慶華，吳韓志，彭興躍，等.用流式細胞儀研究秋茄葉肉細胞大小和葉綠素含量與海水鹽度的關系[J].海洋科學，2003，27(8):67-71.

[7] Huang W，F(xiàn)ang X D,Li G Y,etal. Cloning and expression analysis of salt responsive gene fromKandeliacandel[J]. Biologia Plantarum,2003,47(4):501-507.

[8] Khan N I, Suwa R,Hagihara A,etal. Interception of photosynthetic photon flux density in a mangrove stand ofKandeliacandel(L.) Druce[J]. J For Res,2004,9:205-210.

[9] 陳鷺真，王文卿，林鵬.潮汐淹水時間對秋茄幼苗生長的影響[J].海洋學報，2005，27(2):141-147.

[10] Khan N I, Suwa R,Hagihara A,etal.Allometric relationships for estimating the aboveground phytomass and leaf area of mangroveKandeliacandel(L.) Druce trees in the Manko Wetland, Okinawa Island, Japan[J]. Trees,2005,19:266-272.

[11] 楊盛昌,林鵬.潮灘紅樹植物抗低溫適應的生態(tài)學研究[J].植物生態(tài)學報,1998,22(1):60-67.

[12] 陳鷺真，王文卿，張宜輝,等.2008年南方低溫對我國紅樹植物的破壞作用[J].植物生態(tài)學報,2010,34(2):186-194.

[13] 周涵韜,林鵬.中國紅樹科7種紅樹植物遺傳多樣性分析[J].水生生物學報,2001,25(4):362-369.

[14] Rogers O S,Bendich A J.Extraction of DNA plant tissue,plant molecular[M]//Gelvin S B,Schilpe R A,Verna D S. Plant molecular biology manual. Dordecht: Kluwer Academic Publishiers,1988:1-10.

[15] Loveless M D, Hamrick J L. Ecological determinants of genetic structure in plant populations[J] . Annu Rev Ecol Syst,1984,15:65-95.

[16] 張文彪，金則新，李均敏.不同生境夏蠟梅群體遺傳多樣性的RAPD分析[J].植物研究，2007，27(3)：313.

[17] 林鵬.紅樹林[M].北京:海洋出版社,1984:1-104.

TheEffectsofTemperatureontheGeneticDiversityofThreeKandeliaCandelPopulationsinSympatricIntroducingSite

YANG Juan1, MA Xiaowei2, ZHANG Hongqiong2, ZHOU Yun2, SONG Jianan2,ZHU Yisimeng2, ZHANG Hongqin2, SHI Mengru3

(1.Insitute of Developmental and Regenerative Biology, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2.Renji College,Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China;3.Experimental Teaching Center of Biology, Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035, China)

Kandeliacandelis the northernmost distribution of mangrove in the world. The study about the effects of temperature on the genetic diversity of threeKandeliacandelpopulations in sympatric introducing site is useful to clarify the antifreeze mechanism. RAPD and ISSR molecular markers were used to detect the genetic diversity and genetic differentiation of threeKandeliacandelpopulations in three different latitudes, and the genetic distances were calculated and clustering analyzed with the data of RAPD and ISSR. Both of the two methods showed that these three populations were separated to two groups. Ximen Island and Xiangshangang populations were clustered into one group, because the smallest genetic distance and the maximum genetic identity were found between them. Zhangjiangkou population was clustered into a group, because the largest genetic distance and the minimum genetic identity were found between Zhangjiangkou and Xiangshangang populations. The reason why the genetic diversity drops off is that the fall of temperature.

Kandeliacandel; Randomly amplified polymorphism DNA; inter-simple sequence repeat; genetic diversity

2013-05-22

施孟如(1979—)，女，實驗師，主要從事蛋白質組學和分子生物學研究.E-mail：dreamlike007@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.06.013

Q948

A

1674-232X(2013)06-0544-06