王慧春， 王建禮， 邰發(fā)道＊

（1陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062；2北方民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川750021）

對雌激素（estrogen）及其受體的大量研究表明，雌激素與雄激素（androgen）一樣是雄性生殖所必需的．幼年雄性動物缺失雌激素會直接影響成年后的生殖能力，雌、雄激素通過受體發(fā)揮協(xié)調(diào)作用共同促進雄性生殖［1］．雌二醇（estradiol，E2）作為睪丸生精細(xì)胞存活的保護因子，比雄激素更有效，而且直接影響精子發(fā)生，抑制生精細(xì)胞的凋亡［2］．嚙齒動物睪丸中生殖干細(xì)胞的數(shù)量和精子的成熟受到雌激素調(diào)控［3－4］．給予高劑量的植物雌激素大豆黃酮能夠延擱大鼠睪丸的生長和發(fā)育，并誘導(dǎo)青春期大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)改變［5］．產(chǎn)后1d的大鼠幼仔每日給予1μg的17－β－雌二醇后，觀察產(chǎn)后3d、5d、8d、10d和16d的生殖母細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)外源性雌激素會改變生殖母細(xì)胞向生精小管基層的遷移，可減少細(xì)胞增生和增加程序性死亡，而生殖母細(xì)胞的遷移和其后的增生對于生殖細(xì)胞的存活是必需的［6］．Pelletier等利用免疫組化和原位雜交研究表明，大鼠的次級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞有雌激素α受體（ERα）和ERαmRNA表達［7］．ERα在偶線期和早粗線期的初級精母細(xì)胞及早期的長形精子細(xì)胞中表達強烈［2］．對ERα基因敲除（ErαKO）的雄性小鼠研究證實，雌激素還可以通過影響睪丸輸出小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)和輸出小管的重吸收功能來間接影響睪丸的發(fā)育和精子發(fā)生［8－10］．這些實驗說明雌激素可以從多方面影響睪丸的發(fā)育和精子發(fā)生．但在胚后不同發(fā)育階段的睪丸中，內(nèi)源性雌激素在各級生精細(xì)胞的表達及對精子發(fā)生的調(diào)控還不清楚．棕色田鼠（Microtus mandarinus）主要生活于農(nóng)田果園，營半地下生活，對農(nóng)作物及果樹造成很大危害．此前，我們曾對棕色田鼠胚后發(fā)育的睪丸和附睪內(nèi)ERα和雄激素受體（AR）的分布和表達進行了研究［11－12］，為了進一步探討雌激素在胚后發(fā)育中精子發(fā)生、發(fā)育中的調(diào)控作用，并為從激素角度控制害鼠提供依據(jù)，我們對從出生到成體不同發(fā)育階段的棕色田鼠睪丸和附睪組織內(nèi)的E2表達進行了研究．

1 材料與方法

1．1 動物取材與切片制備

棕色田鼠捕自河南省靈寶市農(nóng)作區(qū)（東經(jīng)111°21′，北緯34°41′，海拔650m）．不同洞群捕捉的雌、雄鼠進行配對．塑料飼養(yǎng)籠（0．4m×0．28m×0．15 m）飼養(yǎng)，木屑做墊料，棉花做巢材，以兔飼料搭配胡蘿卜、麥芽為食．室溫23±1℃，光照周期12L：12D（光周期：07：00—19：00），食物、飲水充足．實驗鼠分別為產(chǎn)后1日齡、10日齡、25日齡、45日齡和60日齡（成體）的雄性鼠，每組6只．幼仔日齡以分娩當(dāng)日為0日計算．稱重后用4mg／mL戊巴比妥鈉麻醉（1mg／100g體重），4%的多聚甲醛灌流固定后，摘取睪丸及附睪，固定于改良的Bouins液．脫水、透明，常規(guī)石蠟切片，制成6μm的連續(xù)切片，切片裱于覆有多聚賴氨酸的載玻片上，恒溫箱烤干．

1．2 免疫組織化學(xué)染色

切片脫蠟復(fù)水后，用1%甲醇－過氧化氫液孵育30min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶．然后進行熱修復(fù)抗原，SABC試劑盒（武漢博士德生物工程公司）中的抗原修復(fù)液在室溫條件下修復(fù)抗原10min，經(jīng)山羊血清于37℃孵育30min后，加入E2兔抗多克隆抗體（1∶1 500稀釋，美國Sigma公司）置于4℃冰箱過夜，再加入生物素化羊抗兔IgG，室溫孵育2h，最后加入試劑盒中的SABC孵育1h，經(jīng)DAB（武漢博士德生物工程公司）顯色，蒸餾水充分沖洗終止反應(yīng)．以上各步驟間均用0．01mol／L的PBS沖洗3次，每次5min．然后按常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡觀察并照像．陰性對照組用0．01mol／L的PBS替代一抗進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，其他步驟同實驗組．

1．3 圖像及數(shù)據(jù)分析

用Qwin V3圖像分析系統(tǒng)（Lecia）對免疫組織化學(xué)結(jié)果進行灰度值測試．每只實驗動物選取3張切片，每張切片測試10個陽性細(xì)胞的灰度值．3張切片陽性細(xì)胞的平均灰度值作為每只動物原始數(shù)據(jù)，然后進行組間比較．測量的灰度值越小，陽性反應(yīng)越強．?dāng)?shù)據(jù)采用SPSS for windows 10．0軟件進行處理，通過t檢驗和One－way Anova進行數(shù)據(jù)分析，在P＜0．05時，選擇Post－Hoc檢驗中LSD法進行多重比較．結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（Mean±SE）．

2 實驗結(jié)果

1日齡，睪丸生精小管內(nèi)生殖母細(xì)胞有E2陽性反應(yīng)．10日齡，生殖母細(xì)胞陽性反應(yīng)減弱（P＜0．05）．25日齡E2陽性表達主要見于精子細(xì)胞；45日齡，精子細(xì)胞和精母細(xì)胞中有E2的表達．成體生精小管中精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中均有E2表達，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞表達較強，精原細(xì)胞表達較弱．1日齡和10日齡的間質(zhì)區(qū)細(xì)胞E2表達最強，25日齡和45日齡表達明顯減弱，成體間質(zhì)細(xì)胞E2表達最弱（P＜0．05）（圖1，表1）．

1日齡至45日齡，E2的表達主要集中在附睪上皮細(xì)胞和連接組織，25日齡E2表達微弱．成體，E2除在上皮細(xì)胞和連接組織表達外，附睪管中的大量精子表達明顯（圖2）．

圖1 不同日齡棕色田鼠睪丸內(nèi)雌二醇的表達Fig．1 Estradiol expression in testes of mandarin voles（Microtus mandarinus）with different age

表1 棕色田鼠胚后發(fā)育中睪丸生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的E2表達（Mean±SE）Tab．1 Immunohistochemistry expression of estradiol in spermatogenic cells and leydig cells of mandarin voles testes during postnatal development（Mean±SE）

圖2 不同日齡棕色田鼠附睪內(nèi)雌二醇的表達Fig．2 Estradiol expression in epididymides of mandarin voles（Microtus mandarinus）with different age

3 討論

RT－PCR技術(shù)研究表明，大鼠的間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中有細(xì)胞色素P450芳香化酶mRNA表達［13］，表明睪丸內(nèi)除體細(xì)胞外，生殖細(xì)胞也可以合成E2．本實驗結(jié)果顯示，在棕色田鼠胚后發(fā)育中，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子中均有E2表達，說明各級生精細(xì)胞均可能有E2生成．1日齡的雄性大鼠幼仔，生殖母細(xì)胞增生并且移向生精小管基層，這個過程有利于精子發(fā)生并且受到雌激素的調(diào)節(jié)［6］．1日齡的棕色田鼠有E2陽性反應(yīng)，說明雌激素對生殖母細(xì)胞的分化有調(diào)節(jié)作用．結(jié)合此前研究棕色田鼠胚后發(fā)育中生精細(xì)胞ERα的增齡變化［11］，我們發(fā)現(xiàn)E2的表達與ERα的表達基本一致，推測E2可能通過ERα調(diào)控生精細(xì)胞的增殖分裂．ERαKO的成年雄性小鼠精子數(shù)目減少，形態(tài)異常，生殖能力下降，說明ERα介導(dǎo)的雌激素作用有利于精子發(fā)生［14］．實驗中25日齡和45日齡生精小管內(nèi)精子細(xì)胞中有E2表達，一直持續(xù)到性成熟．說明棕色田鼠性成熟過程中，在精子發(fā)生的各階段需要雌激素的調(diào)控．雌激素在精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成中具有直接的調(diào)控作用，而且雌激素具有防止未變態(tài)精子細(xì)胞凋亡、維持成熟精子功能的作用［15］．因此，棕色田鼠睪丸胚后發(fā)育過程中，E2對生殖細(xì)胞的分化增殖有重要作用．

間質(zhì)細(xì)胞除生成雄激素外，也是生成E2的主要來源細(xì)胞［16］．在棕色田鼠胚后發(fā)育過程中，E2在間質(zhì)細(xì)胞的表達也間接證明了這一點．結(jié)合對棕色田鼠生精細(xì)胞ERα的研究［11］．可以推測ERα介導(dǎo)雌激素調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育．與生精細(xì)胞不同，不同日齡間質(zhì)細(xì)胞的E2和ERα的表達強度并不一致．這是由于受體具有精細(xì)的調(diào)節(jié)機制，受體隨時與不斷變化的配體及核膜微環(huán)境發(fā)生相互作用，并發(fā)生自適性地改變，致使受體的數(shù)量和反應(yīng)性不斷處于可塑性變換之中，可能上調(diào)也可能下調(diào)［17］．ERα表達強度的變化反應(yīng)了其對雌激素的反應(yīng)性．而且，雌激素對間質(zhì)細(xì)胞的分化作用依賴于間質(zhì)細(xì)胞所處的階段［18］．大鼠出生后第5天注射E2后，到60日齡時睪丸中沒有成熟的間質(zhì)細(xì)胞，說明性成熟前間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育受到E2的抑制．E2可以通過ERα介導(dǎo)抑制間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育從而減少睪酮的分泌［19］．ERα可以通過雌激素反映元件依賴式的機制和雌激素反映元件非依賴式的機制起作用，后者能影響間質(zhì)細(xì)胞睪酮的生物合成［20］．間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的睪酮通過滲透作用進入生精小管，在支持細(xì)胞內(nèi)由芳香化酶催化生成E2，E2在生精小管內(nèi)擴散，作用于生精細(xì)胞從而調(diào)控生精過程［13］．因此，E2通過抑制間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌，實現(xiàn)自反饋，從而精確地調(diào)節(jié)精子發(fā)生．

1日齡至成體的棕色田鼠附睪上皮細(xì)胞和連接組織均有E2表達，25日齡的E2表達微弱，成體附睪管中有大量精子，且有明顯的E2表達．而且1日齡至成體附睪上皮細(xì)胞也有ERα表達［11］．ERαKO的雄性小鼠生殖管道畸變，說明雌激素參與對生殖道上皮的形態(tài)構(gòu)建［21］．E2可能通過ERα的介導(dǎo)影響棕色田鼠附睪的發(fā)育，并且影響精子的成熟．

4 結(jié)論

棕色田鼠從出生至性成熟，睪丸內(nèi)生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有不同程度的E2表達．一方面，間接說明這兩類細(xì)胞是E2生成的重要位點；另一方面，E2在各級生精細(xì)胞及附睪上皮細(xì)胞的表達，說明生精細(xì)胞的分化增殖和精子的成熟都可能受其直接調(diào)控．E2也可以通過調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，調(diào)節(jié)精子發(fā)生．

［1］Oliveira C A，Mahecha G，Carnes K，et al．Differential hormonal regulation of estrogen receptors ERαand ERβ and androgen receptor expression in rat efferent ductules［J］．Reproduction，2004，128（1）：73－86．

［2］Pentikainen V，Erkkila K，Suomalainen L，et al．Estradiol acts as a germcell survival factor in the human testis in vitro［J］．The Journal of Clinical Endocrinology ＆Metabolism，2000，85（5）：2057－2067．

［3］Li H，Papadopoulos V，Vidic B，et al．Regulation of rat testis gonocyte proliferation by platelet－derived growth factor and estradiol：identification of signaling mechanisms involved［J］．Endocrinology，1997，138：1 289－1 298．

［4］Shetty G，Krishnamurthy H，Krishnamurthy H N，et al．Effect of estrogen deprivation on the reproductive physiology of male and female primates［J］．The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，1997，61：157－166．

［5］蔣春霞，潘連軍，馮耀，等．大豆黃酮對雄性大鼠生殖器官生長發(fā)育的影響［J］．中華男科學(xué)雜志，2008，14（4）：351－355．

［6］Vigueras－Villaseor R M，Moreno－Mendoza N A，Reyes－Torres G，et al．The effect of estrogen on testicular gonocyte maturation［J］．Reproductive Toxicology，2006，22（3）：513－520．

［7］Pelletier G，Labrie C，Labrie F．Localization of oestrogen receptorα，oestrogen receptorβand androgen receptors in the rat reproductive organs［J］．Endocrinology，2000，165：359－370．

［8］Hess R A，Dunick D，Lee K H，et al．A role for oestrogen in the male reproductive system［J］．Nature，1997，390：509－512．

［9］Hess R A．Oestrogen in fluid transport in efferent ducts of the male reproductive tract［J］．Reviews of Reproduction，2000，5（2）：84－92．

［10］Hess R A，Bunick D，Bahr J．Oestrogen，its receptors and function in the male reproductive tract：a review［J］．Molecular and Cellular Endocrinology，2001，178（1／2）：29－38．

［11］王慧春，邰發(fā)道，廉漪．棕色田鼠睪丸和附睪雌激素α受體表達的增齡變化［J］．動物學(xué)研究，2005，26（4）：435－441．

［12］王建禮，王慧春，邰發(fā)道．棕色田鼠睪丸和附睪雄激素受體表達的增齡變化［J］．動物學(xué)研究，2009，30（1）：53－58．

［13］Carreau S．Germ cells：a new source of estrogens in the male gonad［J］．Molecular and Cellular Endocrinology．2001，178（1／2）：65－72．

［14］Hess R A，Zhou Q L，Nie R L，et al．Estrogen and epididymal function．［J］．Reporduction，F(xiàn)ertility and Development，2001，13（4）：273－283．

［15］Robertson K M，O′Donnell L，Jones M E，et al．Impairment of spermatogenesis in mice lacking a functional aromatase（cyp19）gene［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of A－merica，1999，96（14）：7986－7991．

［16］Carreau S．Paracrine control of human Leydig cell and Sertoli cell functions．Paracrine control of human Leydig cell and Sertoli cell functions［J］．Folia Histochemistry Cytobiology，1996，34：111－119．

［17］李國璋．神經(jīng)生理學(xué)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：65－95．

［18］Mendis－Handagama S M，Ariyaratne H B．Differentiation of the adult Leydig cell population in the postnatal testis［J］．Biology of Reproduction，2001，65（3）：660－671．

［19］Abney T O．The potential roles of estrogens in regulating Leydig cell development and function：a review［J］．Steroids，1999，64：610－617．

［20］Weiss J，Bernhardt M L，Laronda M M，et al．Estrogen actions in the male reproductive system involve estrogen response element－independent pathways［J］．Endocrinology，2008，149（12）：6 198－6 206．

［21］Nakai M，Bouma J，Nie R，et al．Morphological analysis of endocytosis in efferent ductules of estrogen receptor－αknockout male mouse［J］．The Anatomical Record，2001，263：10－18．