姚粟，張明娟，劉勇，信春暉，許玲，張柏林，程池

1 (北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083)

2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100027)

3(山東扳倒井股份有限公司，山東 高青，256300)

芝麻香型白酒是我國(guó)傳統(tǒng)白酒的重要?jiǎng)?chuàng)新香型之一，其融合了濃香、醬香、清香型白酒的特點(diǎn)，并以優(yōu)雅的芝麻香味而聞名，受到廣大消費(fèi)者青睞［1］。高溫制曲是芝麻香型白酒生產(chǎn)中重要的特點(diǎn)，在制曲過程中最高溫度可達(dá)到65℃，獨(dú)特的高溫環(huán)境富集了大量嗜熱菌［2－3］，研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱芽孢桿菌能夠代謝2，3-丁二醇生成4-甲基吡嗪等芝麻香微量香味物質(zhì)，且能夠產(chǎn)生多種蛋白水解酶，為美拉德反應(yīng)提供多種氨基酸，進(jìn)而推動(dòng)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，生成芝麻香香味成份及其前體物質(zhì)，因此嗜熱菌對(duì)芝麻香型白酒的酒質(zhì)有著重要的貢獻(xiàn)［4］。施安輝［5］等采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法對(duì)徐坊芝麻香型白酒大曲的微生物的分布進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬(Bacillussp．)為高溫大曲中優(yōu)勢(shì)菌屬，徐澤江［6］利用DGGE(變性梯度凝膠電泳)技術(shù)對(duì)芝麻香型白酒高溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)由高溫放線菌屬(Thermoactinomycessp. )和乳酸桿菌屬(Lactobacillussp. )等6 個(gè)菌屬構(gòu)成。曹建全［4］等利用高溫大曲和芝麻香老窖池中選育出的5 株產(chǎn)酶能力較好的嗜熱芽孢桿菌制作麩曲，發(fā)現(xiàn)麩曲質(zhì)量好，能很好地提高芝麻香型白酒產(chǎn)品質(zhì)量，使酒體更加豐滿醇厚，芝麻香更優(yōu)雅。芝麻香型白酒高溫大曲中蘊(yùn)含有豐富的嗜熱細(xì)菌菌種資源，并且這些菌種與芝麻香型白酒酒質(zhì)有密切關(guān)系。因此，從高溫大曲中篩選獲得嗜熱功能菌，為白酒釀造提供優(yōu)良的菌種資源，具有十分重要的意義。

本研究在此基礎(chǔ)上，通過可培養(yǎng)方法從芝麻香型白酒高溫大曲中篩選高溫細(xì)菌，并測(cè)定其蛋白酶活性，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)特征觀察和分子生物學(xué)鑒定，為芝麻香型白酒釀造過程中的微生物強(qiáng)化提供菌種資源，同時(shí)為芝麻香型白酒產(chǎn)香機(jī)理研究提供微生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

芝麻香型白酒高溫大曲曲塊:由山東扳倒井酒廠提供。

1.1.2 菌株

對(duì)照菌株:從濃香型酒曲中分離的1 株地衣芽孢桿菌。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離篩選培養(yǎng)基:成品R2A 固態(tài)培養(yǎng)基。生長(zhǎng)保藏培養(yǎng)基:成品NA 固體培養(yǎng)基。蛋白酶初篩培養(yǎng)基:脫脂奶粉1.5%，瓊脂

1.5 %。

蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基:15 g 麩皮，15 mL 蒸餾水。

1.1.4 試劑

干酪素，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;結(jié)晶紫染液，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;福林試劑，北京索萊寶科技有限公司;TaqDNA 聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker、100bp Marker，天根生物有限公司;Gold-View，北京塞百盛基因技術(shù)有限公司;溶菌酶，Sigma公司、蛋白酶K，Merk 公司;細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，天根公司。其余試劑均購(gòu)自北京化工廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜熱菌株篩選

無菌條件下取芝麻香型白酒高溫大曲樣品約10 g 放入研缽中，將樣品研磨分散后，準(zhǔn)確稱取10 g 磨過的樣品放入已滅菌的三角瓶中，搖勻，制成10－1稀釋液;將三角瓶放入搖床振蕩30 min(37℃，200 r/min);振蕩后，取出靜止1 h;依次稀釋成10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7稀釋度;選取合適稀釋度，吸取100 μL 涂布于R2A 平板上，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行［7］;倒置放于55℃下培養(yǎng)24 h;觀察菌落特征，選取差異明顯的菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩

將分離純化的菌株，用接種針點(diǎn)種于牛奶瓊脂平板上，55℃下培養(yǎng)24 h 后觀察透明圈情況，若產(chǎn)生透明圈，則用直尺測(cè)透明圈直徑(R)與菌落直徑(r)，根據(jù)平板上透明圈直徑和菌落直徑的比值(R/r)，選出能產(chǎn)生較大透明圈的菌株。

1.2.3 產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩

(1)發(fā)酵培養(yǎng)

將初篩所得菌株分別接種于液體NA 培養(yǎng)基中，于50℃、200 r/min 下，培養(yǎng)24 h;將菌液接種于蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基上，接種量為10%，50℃度下培養(yǎng)24 h。

(2)粗酶液制備

稱取4 g 固體發(fā)酵產(chǎn)物，用pH 7.5 的磷酸鹽緩沖液定容至20 mL，混勻，置室溫浸取30 min，每10 min 攪動(dòng)1 次，用低速離心機(jī)(4 000 r/min)離心10 min 取上清液，即為粗酶液［8］。

(3)福林酚法測(cè)定中性蛋白酶活力［9］

福林酚法規(guī)定，1 g 固體發(fā)酵產(chǎn)物在pH 7.5，40℃下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需的酶量為1 個(gè)酶活單位;具體測(cè)定方法見GB/T23527—2009。

1.2.4 菌株鑒定

(1)形態(tài)學(xué)觀察

將菌株劃線培養(yǎng)獲得單菌落，觀察菌落形態(tài)。通過結(jié)晶紫染色在油鏡下觀察菌株菌體形態(tài)。

(2)分子生物學(xué)方法鑒定

A 16S rDNA 序列分析

利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(Tiangen 公司)提取所選菌株的基因組DNA，具體步驟參見試劑盒說明書。以基因組DNA 為模板，利用通用引物對(duì)16S rRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為:正向引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')，反向引物1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')［10］。

50 μL PCR 反應(yīng)體系為:50 ng DNA 模板，1 ×Taqreaction buffer，引物各20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 單位Taq酶(Ferments)。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃復(fù)性40 s，72℃延伸80s，35 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 的瓊脂糖進(jìn)行檢測(cè)。純化后的PCR 產(chǎn)物用ABI3700 基因測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測(cè)序結(jié)果用Chromas 軟件參照正反序列圖譜人工校對(duì)。

將測(cè)序得到的結(jié)果在EzTaxon server 2.1［11］進(jìn)行比對(duì)，確定與已知序列的同源關(guān)系。

B 功能基因分析

以基因組DNA 為模板，利用gyrA 基因通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為:正向引物gyrA-f(5'-CAGTCAGGA AATGCGTACGTCCTT-3')，反向引物gyrA-r

(5'-CAAGGTAATGCTCCA GGCATTGCT-3')［12］。

50 μL PCR 反應(yīng)體系為:50 ng DNA 模板，1 ×Taqreaction buffer，引物各20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 單位Taq酶(Ferments)。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃復(fù)性40 s，72℃延伸80s，35 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 的瓊脂糖進(jìn)行檢測(cè)。純化后的PCR 產(chǎn)物用ABI3700 基因測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測(cè)序結(jié)果用Chromas 軟件參照正反序列圖譜人工校對(duì)。

將測(cè)序得到的結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行比對(duì)［13］，確定與已知序列的同源關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱菌篩選結(jié)果

根據(jù)菌落形態(tài)，挑取形態(tài)差異明顯的菌株，分離純化，共獲得85 株嗜熱菌，4℃斜面保藏，備用。

2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果

從高溫大曲中分離得到10 株肉眼明顯可見透明圈的菌株，透明圈直徑與菌落直徑見表1。

2.3 產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過稀釋不同濃度級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，在680 nm 下測(cè)定光密度OD值，得其標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2 和圖1。

表1 蛋白酶初篩結(jié)果Table 1 the result of the first screening

表2 中性蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 the standard curve of neutral protease

圖1 中性蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 the standard curve of neutral protease

2.3.2 中性蛋白酶酶活測(cè)定結(jié)果

將10 株初篩所得的菌株和對(duì)照菌株分別發(fā)酵培養(yǎng)，應(yīng)用福林酚法測(cè)定中性蛋白酶活力，結(jié)果見表3。

表3 蛋白酶復(fù)篩結(jié)果Table 3 the result of the second screening

從表1 和表3 結(jié)果可以看出，M5 菌株的透明圈直徑D(cm)/菌落直徑d(cm)值最大，固體發(fā)酵后測(cè)得酶活也最高，酶活力約是對(duì)照菌株酶活力的3 倍，說明M5 有很好的蛋白分解作用。由于菌株的準(zhǔn)確鑒定是生產(chǎn)應(yīng)用的前提，所以本研究選擇M5 菌株進(jìn)行鑒定，以確定其種屬。

2.4 M5 菌株鑒定

2.4.1 M5 菌株形態(tài)特征觀察

M5 菌株菌落為乳白色，表面粗糙，邊緣整齊，不透明，較黏稠。菌體呈長(zhǎng)桿狀，單個(gè)居多，有少數(shù)兩連桿、三連桿、鏈狀現(xiàn)象，見圖2。

圖2 M5 菌體、菌落形態(tài)Fig.2 The mycelia and colonial morphology of strain M5

2.4.2 M5 分子生物學(xué)方法鑒定結(jié)果

(1)16S rDNA 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株M5 的基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增出16S rDNA 序列，大小約為1500bp，電泳檢測(cè)結(jié)果見圖3。將M5 的16S rDNA 序列在EzTaxon server 2.1 上進(jìn)行比對(duì)，依16S rDNA 序列經(jīng)B1ast 比對(duì)后構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5，通過分析可知該菌為芽孢桿菌屬(Bacillussp. )。

(2)功能基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株M5 的基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增出gyrA 基因序列，大小約為1000bp，電泳檢測(cè)結(jié)果見圖4。將M5 的gyrA 基因序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，依gyrA 基因序列經(jīng)BLAST 比對(duì)后構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，菌株M5 與枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilissubsp.Subtilis)的模式菌株KCTC 3135 聚類在一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支，序列同源性為100%以上，可確定M5 為枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilissubsp.subtilis)。

圖3 M5 的16S rDNA 序列電泳檢測(cè)Fig.3 PCR amplification of 16S rDNA fragments of the strain M5

圖4 M5 的gyrA 基因序列電泳檢測(cè)Fig．4 PCR amplification of gyrA fragments of the strain M5

圖5 菌株M5 16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 The phylogenetic analysis of M5 16S rRNA genes

3 討論

嗜熱菌為高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)菌屬，包括芽孢桿菌屬(Bacillussp. )和高溫放線菌屬(Thermoactinomycessp. )等［5－6］。嗜熱芽孢菌可在高溫環(huán)境中產(chǎn)生蛋白酶以增加游離氨基酸的含量，為美拉德反應(yīng)提供充足的前提物質(zhì)［4］，從而有利于形成白酒中各種風(fēng)味物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌麩曲的培養(yǎng)過程中，地衣芽孢桿菌所產(chǎn)的中性蛋白酶可以輔助河內(nèi)白曲等霉菌產(chǎn)的酸性蛋白酶對(duì)原料中的復(fù)雜蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，對(duì)于提高芝麻香型白酒的出酒率和品質(zhì)具有重要的意義［14］。此外，有研究指出，將枯草芽孢桿菌制作成麩曲應(yīng)用于白酒生產(chǎn)，可以增加白酒中吡嗪類化合物含量，有助于賦予白酒良好的醬香和芝麻香風(fēng)味［15］，嗜熱芽孢菌對(duì)于揭示白酒中香味物質(zhì)的形成機(jī)制，提高優(yōu)質(zhì)酒率有重要意義。高溫放線菌屬菌種由于其形態(tài)學(xué)特征最初被歸為放線菌類，但是近年來系統(tǒng)發(fā)育分析已將其歸入芽孢桿菌目(Bacillales)、高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)［16］。徐澤江［6］利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對(duì)芝麻香型白酒高溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高溫放線菌屬菌種為高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)菌屬，與姚粟等［17］利用16S rDNA克隆文庫技術(shù)對(duì)芝麻香型白酒高溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究的結(jié)果一致。劉洋［18］等通過可培養(yǎng)方法從芝麻香型白酒高溫大曲中分離獲得高溫放線菌ZM60，經(jīng)多相分類鑒定為普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)。高溫放線屬菌種在芝麻香型白酒釀造及香味成分形成過程中發(fā)揮的作用有待于進(jìn)一步研究。

本研究篩選出的嗜熱細(xì)菌M5 蛋白酶活力較高，從55℃下分離，且在50℃下生長(zhǎng)良好，經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilissubsp.Subtilis)?？莶菅挎邨U菌因其能夠產(chǎn)生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶、木聚糖酶等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各類食品生產(chǎn)中［19］。有研究者從枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物譜中檢測(cè)到一定濃度的乙偶姻、四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2，3-丁二酮、2，3-丁二醇、乙醇和乙酸乙酯等揮發(fā)性物質(zhì)以及乳酸和乙酸等有機(jī)酸［20］，這些代謝產(chǎn)物均為白酒中風(fēng)味前體物質(zhì)或風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)白酒香氣有重要貢獻(xiàn)。大多數(shù)枯草芽孢桿菌在50℃的高溫環(huán)境中不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不良［21］，而本研究分離得到的這株枯草芽孢桿菌枯草亞種在50℃下生長(zhǎng)良好，產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。后續(xù)研究可將以分離得到的Bacillus subtilissubsp.subtilisM5 菌株作為出發(fā)菌株，對(duì)其產(chǎn)酶產(chǎn)香機(jī)理進(jìn)行研究，并進(jìn)一步將該菌種應(yīng)用于白酒生產(chǎn)過程中，以期提高和穩(wěn)定芝麻香型白酒的產(chǎn)量和酒質(zhì)。

圖6 菌株M5 gyrA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 The phylogenetic analysis of M5 gyrA genes

［1］ 王海平，來安貴，趙德義. 芝麻香型白酒的發(fā)展［J］． 釀酒科技，2006，147(9):104 －107.

［2］ 信春暉. 芝麻香酒典型風(fēng)格的形成［J］． 釀酒科技，2006(6):104 －105.

［3］ 信春暉. 扳倒井復(fù)糧芝麻香型白酒生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)［J］． 釀酒科技，2010，189(3):65 －66.

［4］ 曹建全，劉建波，薛德峰. 芝麻香型白酒細(xì)菌曲研制［J］． 釀酒，2010，37(6):35 －38.

［5］ 施安輝，李麗莉，卞建平. 徐坊芝麻香型酒專用大曲中主要微生物的分布、優(yōu)勢(shì)菌種的鑒定及代謝產(chǎn)物的初步分析［J］． 山東食品發(fā)酵，2010，156(1):8 －10.

［6］ 徐澤江. 芝麻香型白酒釀造微生物多樣性研究［D］．浙江理工大學(xué)，2012:44 －46.

［7］ 杜連祥. 工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］． 天津:科學(xué)技術(shù)出版社，1992:123.

［8］ 胡喜巧，李蘭，蔣愛鳳. 米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶提取與粗酶性質(zhì)研究［J］． 河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，39(2):43 －48.

［9］ GB23527 －2009 ICS67.220.22 X69 －2009，蛋白酶制劑［S］．

［10］ Yang Liu，Lin Liu，F(xiàn)ubin Qiu，et al.Paenibacillus hunanensissp.nov.，isolated from rice seeds［J］． International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2010，60:1266 －1270.

［11］ Chun J，Lee J H，Jung Y，et al.EzTaxon:a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences［J］． Int J Syst Evol Micr，2007，57:2 259 －2 261.

［12］ Jongsik Chun，Kyung Sook Bae.Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partialgyrA gene sequences［J］． Antonie van Leeuwenhoek，2000，78(2):123 －127.

［13］ Kim D Pruitt，Donna R Maglott.RefSeq and LocusLink:NCBI gene-centered resources［J］． Nucleic Acids Research，2000，29(1):137 －140.

［14］ 袁超，崔樂芳，王瑞明. 地衣芽孢桿菌在麩曲中產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵工藝條件的研究［J］． 釀酒科技，2011，201(3):40 －42.

［15］ 施小明，徐巖，崔鳳元，等. 枯草芽孢桿菌在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］． 釀酒科技，2012，212(2):49 －53.

［16］ 張燕新，吳瑩，張跡. 高溫放線菌分類的研究進(jìn)展［J］． 微生物學(xué)雜志，2007，27(1):64 －68.

［17］ 姚粟，葛媛媛，李輝，等. 利用非培養(yǎng)技術(shù)研究芝麻香型白酒高溫大曲的細(xì)菌群落多樣性［J］． 食品發(fā)酵與工業(yè)，2012，38(6):1 －6.

［18］ 劉洋，趙婷，姚粟. 一株芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱放線菌的分離與鑒定［J］． 生物技術(shù)通報(bào)，2012(10):210 －216.

［19］ 馬明，杜金華. 枯草芽孢桿菌酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］． 山東科學(xué)，2006，19(3):35 －37.

［20］ 徐巖，吳群，范文來，等. 中國(guó)白酒中四甲基吡嗪的微生物產(chǎn)生途徑的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)［J］． 釀酒科技，2011，205(7):37 －40.

［21］ 東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］． 天津:科學(xué)技術(shù)出版社，2001:63.