王彥鳳，吳曼琳，王曉晶，王婧，李洋，連夢(mèng)瑤，王志鋼

1 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021

2 赤峰市醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000

胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (Extracellular regulated protein，Erk)是絲裂原激活蛋白激酶 (Mitogen activated protein kinase，MAPK)家族中的一個(gè)亞族，是Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的重要成分，該信號(hào)通路介導(dǎo)著多種生物學(xué)效應(yīng)，如細(xì)胞的增殖、分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[1]。該酶被激活后，成為磷酸化的ERK (p-ERK)，p-ERK可以介導(dǎo)信號(hào)由胞漿向胞核傳遞，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、分裂等多種生理過(guò)程，其異常表達(dá)在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。對(duì)erk基因的研究不僅可以區(qū)別物種間的遺傳差異和進(jìn)化特征，而且對(duì)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)及個(gè)體發(fā)育過(guò)程中對(duì)外界影響因素的反應(yīng)機(jī)制研究具有重要意義。早在 1990年，Boulton等發(fā)現(xiàn)了一種與酵母KSS1和FUS3激酶有著驚人相似的酶，被稱為ERK1[3]。1991年，Boulton等繼而發(fā)現(xiàn)了一類 ERK酶類，定義為ERK1、ERK2和ERK3等。ERK1和ERK2基因有90%的同源性，相對(duì)分子量分別為44 kDa和42 kDa[4]。Srinivasan等發(fā)現(xiàn)在鼠類血管發(fā)生中，Ras介導(dǎo)的信號(hào)通路是內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的必要條件，缺乏ERK1/2會(huì)抑制初期內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[5]。Miltenberger等應(yīng)用反義c-Raf1或抑制性Raf1使NIH3T3細(xì)胞的增殖受到干擾，而組成性激活的Raf1能加速增殖過(guò)程[6]。在許多腫瘤細(xì)胞中，都能檢測(cè)到ERK信號(hào)通路的異?；罨?，Boucher等研究表明胰腺癌組織中的 ERK活性是癌組織周圍正常組織的 2～18倍。Kang等研究表明，白血病細(xì)胞K562凋亡特性與ERK基礎(chǔ)活性較高有關(guān)[7]。ERK通路與細(xì)胞周期的調(diào)控有著緊密的聯(lián)系。有資料顯示，ERK信號(hào)通路是多數(shù)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子調(diào)控靶細(xì)胞增殖的重要途徑[8]。運(yùn)用MEK抑制劑U0126阻斷ERK通路，會(huì)抑制細(xì)胞周期蛋白D1 (CyclinD1)表達(dá)[9]。使用MEK抑制劑PD98059處理HT1080細(xì)胞，24 h后細(xì)胞仍然停留在G2/M期，使細(xì)胞周期阻滯[10]。內(nèi)蒙古白絨山羊是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選育形成的優(yōu)良地方性絨肉兼用型品種，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求、利用與代謝有其特殊性。erk基因及其編碼的蛋白已在一些動(dòng)物中得到深入研究，但尚未有山羊erk基因研究方面的報(bào)道。建立有效地克隆內(nèi)蒙古白絨山羊 erk2基因的 RT-PCR體系及定量RT-PCR體系，獲得erk2基因編碼區(qū) cDNA序列及該基因的基本表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究該基因產(chǎn)物在機(jī)體發(fā)育中的作用提供條件。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)載體及試劑

克隆載體 pMD19-T Vector、LA-Taq DNA polymerase、T4 DNA 連接酶以及 10×T4 DNA連接酶緩沖液、常用限制性內(nèi)切酶及緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000、氨芐青霉素、卡那霉素、X-gal、IPTG、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 (50次量)、RNAiso試劑盒 (TaKaRa，Cat. No. 3124)等均購(gòu)自寶生物工程 (大連)有限公司 (TaKaRa)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 (DP209-02離心柱型)購(gòu)自TIANGEN BIOTECH (BEIJING)CO., LTD.；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物組織及細(xì)胞培養(yǎng)

內(nèi)蒙古白絨山羊40 d的胎兒采自內(nèi)蒙古白絨山羊種羊場(chǎng)，帶回實(shí)驗(yàn)室后經(jīng)原代培養(yǎng)純化胎兒成纖維細(xì)胞，于液氮中保存。繼代培養(yǎng)采用單層培養(yǎng)子代細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)使用P1至P4代次之間的胎兒成纖維細(xì)胞。所用培養(yǎng)基為含有 10%FBS的 DMEM/F12，培養(yǎng)條件為 37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件。

脾、睪丸、腦、肝、肺、乳腺和腎等組織樣本取自新屠宰羊，迅速放入-196 ℃的液氮中冷凍后并置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按總 RNA提取試劑盒 (RNAiso Reagent)說(shuō)明書(shū)的操作方法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性，經(jīng)紫外線測(cè)定定量后，用Oligod(T)18-Primers按照反轉(zhuǎn)錄酶AMV說(shuō)明書(shū)的方法反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA (cDNA1)，作為下一步PCR擴(kuò)增編碼區(qū)片段的模板。

1.4 內(nèi)蒙古白絨山羊erk2基因的分子克隆

從GenBank中查找出與絨山羊親緣關(guān)系較近的牛、馬、小鼠、大鼠、人等物種的erk2基因的CDS區(qū)序列，并進(jìn)行同源比對(duì)。根據(jù)erk2基因的CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)引物P1 (表1)，其中包含的酶切位點(diǎn)為SacⅠ、NdeⅠ (上游)，XhoⅠ、PstⅠ (下游)。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度1 083 bp，以絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 30 s℃，58 30 s℃，72 ℃16 s，30個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收特異性條帶，將其克隆到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α。藍(lán)、白菌落篩選陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR與酶切鑒定正確后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)方法

基因cDNA序列用NCBI上的BLAST進(jìn)行序列比對(duì) (http：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，開(kāi)放閱讀框 (ORF)預(yù)測(cè)采用 ORF Finder軟件(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用SMART程序 (http://smart.embl.de/)，蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)分析采用 Psite程序 (http://www.softberry.com)，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位采用 PSORT程序 (http://psort.nibb.ac.jp)，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及分子量預(yù)測(cè)采用在線軟件 (http://isoelectric.ovh.org/)分析，用 MEGA4.1軟件進(jìn)行同源性比對(duì)及構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，利用瑞士模型工作區(qū)(Swiss-Model workspace)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(http:// swissmodel.expasy.org/)。

1.6 定量RT-PCR檢測(cè)組織表達(dá)特異性

1.7 利用免疫組化方法檢測(cè)組織表達(dá)特異性

收集內(nèi)蒙古白絨山羊睪丸組織材料，按下列步驟處理：4%的多聚醛固定，酒精脫水，包埋，切片，酒精脫蠟，免疫動(dòng)物血清封閉，一抗 (Rabbit anti-ERK2)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育 10 min，PBS洗 3次，依據(jù)試劑盒的說(shuō)明利用 DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)染色，顯微鏡觀察，照相，每種組織設(shè)一個(gè)負(fù)對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 erk2基因克隆與序列分析

絨山羊erk2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)分析，在預(yù)期的1 083 bp處有特異性擴(kuò)增條帶 (圖1)。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切雙重鑒定正確。序列測(cè)定結(jié)果表明，擴(kuò)增出的CDS全長(zhǎng)1 083 bp，編碼360個(gè)氨基酸。通過(guò)Blast比對(duì)，內(nèi)蒙古白絨山羊erk2基因的核苷酸序列與牛Bos taurus (BC133588.1)、狼 Canis lupus (NM_001110800.1)、人 Homo sapiens (NM_138957.2)、 野 豬 Sus scrofa(NM_001198922.1)、 小 鼠 Mus musculus(NM_011949.3)、 大 鼠 Rattus norvegicus(NM_053842.1)等物種的同源性分別為 96%、96%、92%、92%、89%和 89%，相應(yīng)的氨基酸序列同源性均達(dá)到 96%以上，與牛的同源性更達(dá)到了 100%。序列提交 GenBank得到序列登記號(hào)為 JX569765。使用 MEGA4.1軟件對(duì)上述序列進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù) (圖 2)，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，erk2是一個(gè)相對(duì)保守的基因，在各物種間的差異非常小。

表1 本研究中用到的引物Table 1 Primers used in this study

圖1 erk2基因cDNA全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR product of erk2 gene. M1: λ-EcoT14 DNA marker; 1: PCR products; 2: negative control; 3: β-actin positive control; M2: DL 2 000 DNA marker.

圖2 各物種erk2核苷酸聚類分析Fig. 2 Alignment of several species of erk2 nucleotide sequence.

2.2 生物信息學(xué)分析

erk2基因編碼一個(gè)由 360個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，該蛋白理論分子質(zhì)量41.38 kDa，等電點(diǎn) (pI)為 6.711，氨基酸組成中亮氨酸含量最高，為11.9%。SMART分析表明，在該蛋白質(zhì)中 25～313位氨基酸是一個(gè) S_TKc結(jié)構(gòu)域(Serine/threonine kinase catalytic domain)，即絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域 (圖3)。已知的ERK蛋白是典型的絲/蘇氨酸激酶，SMART分析結(jié)果進(jìn)一步表明絨山羊erk2基因被正確克隆。

利用Swiss-Model workspace[12-14]預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu) (圖 4)。對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行 Psite分析表明，含 2個(gè) N-糖基化位點(diǎn)、1個(gè)依賴于 cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)蛋白激酶c磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、2個(gè) N-豆蔻?；稽c(diǎn)、2個(gè)異戊二烯基結(jié)合區(qū) (CAAX box)、7個(gè)微體羧基端靶向信號(hào)、2個(gè)蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)標(biāo)記及一個(gè)絲/蘇氨酸蛋白激酶活性區(qū)域標(biāo)記 (圖5)。PSORT (k-NN prediction)程序預(yù)測(cè)其定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖3 erk2基因編碼蛋白質(zhì)SMART分析 (圖中數(shù)字為氨基酸編號(hào))Fig. 3 SMART analysis of the protein translated from erk2 gene (The number shows the location of each domain in protein).

圖4 ERK2蛋白的3D圖(9?358氨基酸序列)Fig. 4 Three-dimensional models of certain regions of ERK2 ( amino acid residues 9 to 358).

2.3 組織表達(dá)特異性檢測(cè)

經(jīng)定量RT-PCR顯示檢測(cè)，erk2基因在內(nèi)蒙古絨山羊的心臟、脾、腎、肺、皮膚及乳腺組織中均有不同程度的表達(dá)。其中心臟、皮膚以及乳腺組織中mRNA豐度較高，脾、腎中的表達(dá)相對(duì)較低 (圖 6)。利用免疫組化方法檢測(cè)ERK2蛋白在睪丸中有特異性的表達(dá) (圖7)。

3 討論

ERK屬于絲裂原激活蛋白激酶 (Mitogen activated protein kinase，MAPK)家族中的一個(gè)亞族，包括ERK1與ERK2，后者研究更加深入。人類的 ERK2蛋白包括360個(gè)氨基酸殘基，而鼠類包括 358個(gè)氨基酸殘基[15]。該家族的蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)典型的特征：一是TXY三肽基，被稱為“磷酸化唇”或“活化唇”，ERK2的上游信號(hào)分子通過(guò)識(shí)別這一結(jié)構(gòu)來(lái)活化ERK2，已報(bào)道的ERK2三肽基為“TEY”；另一個(gè)是絲氨酸/蘇氨酸激酶催化活性的S_TKc結(jié)構(gòu)域。本試驗(yàn)所克隆的內(nèi)蒙古白絨山羊erk2基因ORF推測(cè)編碼360個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)經(jīng)SMART程序分析具有這兩種保守位點(diǎn)，與其他物種的 ERK2蛋白相符，證明內(nèi)蒙古白絨山羊erk2基因被正確克隆。

Boulton等[2]通過(guò) Northern blotting方法研究erk基因的組織特異性表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在小鼠的各種組織中均有表達(dá)，對(duì)于erk2來(lái)說(shuō)，發(fā)現(xiàn)其在肌肉、胎盤(pán)以及大腦中的表達(dá)量最高。而且利用Western blotting的方法研究得到了相同的結(jié)果。本研究利用定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，erk2基因在內(nèi)蒙古白絨山羊的心臟、脾、腎、肺、皮膚及乳腺組織中均有不同程度的表達(dá)。表明erk2基因可在多種組織中表達(dá)，進(jìn)一步證明該基因在哺乳動(dòng)物中具有保守的功能。

圖5 內(nèi)蒙古白絨山羊ERK2氨基酸序列與牛、小鼠及人的氨基酸序列比較及Psite活性位點(diǎn)分析 (1個(gè)依賴于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn) (氨基酸序列為KKLS)，以雙波浪線標(biāo)記；3個(gè)蛋白激酶c磷酸化位點(diǎn) (氨基酸序列為TLR、TAR及SNR)，以灰色底紋標(biāo)記；5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn) (氨基酸序列為SAYD、SPFE、TLRE、TTCD 及 SQED)，以方框標(biāo)記；2個(gè)蛋白激酶 ATP 結(jié)區(qū) (氨基酸序列為IGEGAYGMVCSAydnvnkvrVAIK、IGEGAYGMVCSAydnvnkvrvAIKK)，以點(diǎn)下劃線標(biāo)記；1個(gè)絲/蘇氨酸蛋白激酶活性區(qū)域 (氨基酸序列為 VLHRDLKPSNLLL)，以灰色下劃線標(biāo)記；2個(gè) N-糖基化位點(diǎn) (氨基酸序列為NLSY、NTTC)，以波浪線標(biāo)記)Fig. 5 Alignment of protein ERK2 amino acids sequence between Inner Mongolia Cashmere Goat and Bos taurus,Mus musculus and Homo sapiens. The active sites are searched by Psite. A cAMP/cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site (KKLS)is marked by double wavy line; Three protein kinase C phosphorylation sites(TLR/TAR/SNR)are marked by gray shadow. Five casein kinase phosphorylation sites(SAYD/SPFE/TLRE/TTCD/SQED)are marked by pane. Two protein kinase ATP-binding regions(IGEGAYGMVCSAydnvnkvrVAIK/IGEGAYGMVCSAydnvnkvrvAIKK)are marked by hidden underline; A Ser/Thr protein kinase activity region (VLHRDLKPSNLLL)is marked by gray underline. Two N-glycosylation site(NLSY/NTTC)are marked by wavy line.

圖6 定量RT-PCR檢測(cè)內(nèi)蒙古白絨山羊erk2基因組織表達(dá)特異性Fig. 6 Tissue-specific expression of erk2 gene of Inner Mongolia Cashmere Goat by quantitative RT-PCR.

圖7 睪丸中ERK2的表達(dá)Fig. 7 Expression of ERK2 protein in testis. (A)Negative control. (B)ERK2 is expressed in brown tissue cells. Scale bars=25 μm.

Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路可以感應(yīng)多種信號(hào)分子，參與多種細(xì)胞進(jìn)程，與多種疾病發(fā)生密切相關(guān)，如：腦損傷[16]、癌癥[17]、肥胖[18]、糖尿病[19]以及炎癥[20-21]等。近年來(lái)隨著ERK的深入研究，一些新的功能也被相繼報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的壓力會(huì)降低小鼠海馬體以及前額皮質(zhì)中ERK的表達(dá)，而利用氟西汀處理會(huì)抵消這種反應(yīng)[22]，這一新功能的發(fā)現(xiàn)為抗抑郁癥藥物的研發(fā)帶來(lái)了新的思路[23]。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，MAPK/ERK信號(hào)通路與血清饑餓引起的人成骨細(xì)胞凋亡相關(guān)[24]。

內(nèi)蒙古白絨山羊 (Inner Mongolia Cashmere Goat)是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育而形成的優(yōu)良產(chǎn)絨品種，但近年來(lái)由于草場(chǎng)退化，種群數(shù)量增加，舍飼比例加大，導(dǎo)致其生產(chǎn)性能降低，這其中機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量信號(hào)刺激的敏感性起著重要的作用，但機(jī)制尚不清楚。多項(xiàng)研究顯示ERK通路在營(yíng)養(yǎng)攝入與調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，如ERK通路可以調(diào)節(jié)氨基酸刺激細(xì)胞后的信號(hào)傳遞過(guò)程[25]；動(dòng)物食料中缺乏必需氨基酸時(shí)，會(huì)激發(fā)ERK信號(hào)通路而不是mTOR信號(hào)通路[26]；ERK信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)氨基酸運(yùn)輸從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖[27]。本研究正確克隆了內(nèi)蒙古白絨山羊erk2基因并對(duì)其基本表達(dá)模式進(jìn)行了分析，這些結(jié)果將為進(jìn)一步研究ERK在絨山羊細(xì)胞生長(zhǎng)和早期胚胎發(fā)育中的功能及發(fā)揮作用的分子機(jī)制提供條件。

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