陳玲，呂靜靜，於學(xué)禪，康騁，竺亞斌

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211

食道是消化道中很重要的一個(gè)組成部分，擔(dān)負(fù)著將水和食物從口咽部輸送至胃部的功能?？墒侨澜缫蚴车啦∽円鸬男掳l(fā)病患及死亡病患正逐年增加，其中發(fā)病情況最為嚴(yán)峻的是食道癌[1]。據(jù)研究 90%的食道癌發(fā)生在食道上皮組織，由鱗狀上皮細(xì)胞變異所致；另外約 10%的腺癌先由鱗狀上皮變異為含腺體上皮然后再演變成食管腺癌的[2-3]。從上面來看，上皮組織變異是導(dǎo)致食道癌發(fā)生的主要原因之一，因此構(gòu)建工程化食道上皮替代病變組織顯得尤為重要。

聚乳酸 (PLA)是 FDA認(rèn)可的具有良好生物相容性和降解性的生物材料，在組織工程中被廣泛用于骨、軟骨、人造皮膚、周圍神經(jīng)等的支架基材[4-6]。但是由于疏水性和細(xì)胞惰性導(dǎo)致其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定限制[7]。人們對(duì)PLA進(jìn)行了一些改性研究，如加入殼聚糖、明膠等天然生物大分子[8-9]或與聚乙醇酸、聚多巴胺等親水性高分子[10-11]共混或共聚來提高其親水性及細(xì)胞相容性。我們實(shí)驗(yàn)室則將PLA與絲素蛋白 (SF)結(jié)合使用以期克服 PLA的這些缺陷。絲素蛋白是從蠶絲中提取的一種天然生物大分子，作為手術(shù)縫線用于臨床已有 100多年的歷史。組成絲素蛋白的氨基酸主要是極性氨基酸，能為細(xì)胞提供結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)機(jī)體細(xì)胞粘附力強(qiáng)，且具有緩慢降解性以及良好的力學(xué)性能和氧氣滲透性[12-14]。

在前期實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)支持上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的基膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)基膜由納米纖維相互交織而成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維直徑從28到165 nm，平均為 (66±24)nm，基膜厚度從53到151 nm，平均 (86±15)nm，主要成分是IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白及蛋白聚糖等[15]。本文根據(jù)上皮細(xì)胞與基膜相互作用、相互依存的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將 PLA和 SF共混紡絲，制備PLA/SF電紡支架，并將從豬食道中提取的基膜蛋白混合液涂覆接枝其上，以期構(gòu)建具有天然構(gòu)造的食道上皮組織，為將來替代或修復(fù)病變食道上皮組織提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

聚乳酸 (PLA，Mn 300 kDa，寧波環(huán)球生物材料有限公司)；蠶絲 (寧波市江東吉達(dá)貿(mào)易有限公司)；三氟乙酸 (TFA，上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司)；DMEM、Dispase、AAS (100 U/mL penicillin，100 U/mL streptomycin，0.25 g/mL amphotericin B)、FBS (Gibco公司，美國(guó))；鼠抗人角蛋白 14抗體 (CK14，Santa Cruz Biotechnology)；FITC-標(biāo)記羊抗鼠IgG (北京奧博森生物科技公司)；4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)；所有用于Western blotting實(shí)驗(yàn)的試劑購于碧云天生物試劑研究所；其余試劑均購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，本實(shí)驗(yàn)所使用的水均為去離子水。

1.2 絲素蛋白 (SF)的提取

將蠶絲剪碎，置于0.5% Na2CO3水溶液中煮沸1 h，用水反復(fù)沖洗干凈蠶絲表面的絲膠，烘干。取脫膠后的蠶絲與Ca2(NO3)2·4H2O共混，其浴比為蠶絲：Ca2(NO3)2·4H2O=1∶20，80 ℃水浴溶解1.5 h，用水透析3 d，每4 h換水1次，使用 20 000分子量的聚乙二醇濃縮至低含水量，冷凍真空抽干，得海綿狀絲素蛋白，備用。

1.3 電紡絲支架的制備

將PLA溶于二氯甲烷及二甲基甲酰胺 (DMF)混合液 (3∶2，V∶V)中，PLA、SF 按比例 (1∶2，W∶W)溶于三氟乙酸中，制備成濃度為 0.10～0.25 g/mL的PLA、PLA/SF電紡液，利用本實(shí)驗(yàn)室自制的靜電紡絲系統(tǒng)[15]進(jìn)行電紡，通過調(diào)節(jié)電壓10～25 kV、接收距離7～11 cm以及流速0.2～1.5 mL/h，得到不同形態(tài)的纖維膜，在光鏡下觀察電紡纖維的尺寸是否均勻，是否有液滴產(chǎn)生，確定電紡條件。利用錫紙和玻片 (Ф14 mm)作為承載電紡絲纖維的載體，其中錫紙載體是為了進(jìn)行纖維支架表征，玻片是為了檢測(cè)細(xì)胞相容性，收集的纖維膜室溫晾干后，置于 4 ℃保存，備用。

1.4 豬食道基膜蛋白的提取與支架上的涂覆接枝

從屠宰場(chǎng)獲得豬食道粘膜及粘膜下層，洗凈，剪碎，依次浸入以下溶液中低溫勻漿，1) 3.4 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，蛋白酶抑制劑(2 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L N-甲基馬來酰亞胺)；2)0.5 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，蛋白酶抑制劑。勻漿液低溫離心 (8 000 r/min，20 min)，取上清液存于-70 ℃，備用[16]。

將上述制備的PLA電紡支架置于24孔培養(yǎng)板中，每孔滴加300 μL蛋白提取液，4 ℃冰箱放置24 h，PBS清洗3次，去除多余蛋白，真空凍干后4 ℃冷藏，備用。

1.5 電紡絲支架的表征

1.5.1 掃描電鏡觀察

將電紡纖維膜利用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上，表面噴金 (E-1010，Hitach)80 s后在掃描電鏡 (SEM)(S-3400N，Hitach)下觀察纖維的形態(tài)并拍照。利用Image J圖像分析軟件對(duì)電鏡圖像進(jìn)行分析，每個(gè)樣品選取3張SEM圖片，每張圖片至少對(duì)30根纖維進(jìn)行直徑的測(cè)量，纖維直徑用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示。

1.5.2 力學(xué)性能測(cè)試

將電紡纖維膜裁成測(cè)試有效長(zhǎng)度為2 cm，寬度1 cm的啞鈴狀，利用測(cè)厚儀測(cè)得樣品厚度在0.1～0.3 mm之間，每組纖維膜取3個(gè)樣品，在力學(xué)測(cè)試儀 (3 366，Instron)上以1 mm/min的加載速度施加應(yīng)力進(jìn)行拉伸測(cè)試，測(cè)試結(jié)果取平均值。

1.5.3 降解性能測(cè)試

備用電紡纖維膜用75%的酒精浸泡2 h消毒處理后，再用滅菌PBS進(jìn)行漂洗，最后浸入含100 U/mL雙抗的PBS (pH 7.4)溶液中，37 ℃水浴，按1 d、3 d、7 d、15 d、30 d、60 d等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。取出的樣品用蒸餾水洗滌干凈，真空抽干后稱重。每組支架每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取 3個(gè)平行樣品，取平均值。按下列公式計(jì)算失重率：

其中，Wl代表失重率 (%)；W0代表原重；Wr代表余重。

1.6 支架細(xì)胞相容性研究

1.6.1 支架的預(yù)處理

75%酒精浸泡電紡纖維膜支架4 h，PBS置換去凈酒精，DMEM培養(yǎng)基浸泡0.5 h后吸去多余培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中，待接種細(xì)胞。

1.6.2 上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及支架上種植

取屠宰場(chǎng)現(xiàn)宰新鮮豬食管3～4 cm，沿縱軸切開后，修剪去除肉眼可見的粘膜下組織，以含100 U/mL雙抗的PBS溶液輕輕刮洗粘膜上層表面，95%酒精沖洗1次，75%酒精沖洗1次，1%次氯酸鈉輕輕刮洗1 min，PBS清洗3次，浸入含100 U/mL雙抗的PBS中帶回。實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)中，5%碘伏浸泡3 min，PBS清洗干凈；然后將標(biāo)本浸入50 mg/mL Dispase分離酶消化液(PBS配制)，4 ℃過夜，使鱗狀上皮細(xì)胞層與基底的間質(zhì)層分離。隨后將上皮層剪碎，用胰蛋白酶在37 ℃水浴條件下消化10 min，將鱗狀上皮細(xì)胞層分離為單細(xì)胞懸液，用等量含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打均勻，棄去組織碎塊，1 500 r/min離心5 min，棄上清，含100 U/mL AAS的完全培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，接種在培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)箱中 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h第1次換液，然后每隔4 d換液1次，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右后用胰蛋白酶消化，按1∶2分瓶傳代。取2～4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6.3 支架上細(xì)胞形態(tài)觀察

0.25 %胰蛋白酶消化培養(yǎng)中上皮細(xì)胞，利用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2.6×104cells/cm2的密度種植于聚苯乙烯 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (TCPS)中的電紡纖維膜支架上。14 d后終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗干凈，2.5%戊二醛水溶液室溫固定0.5 h，PBS清洗 3次，蒸餾水清洗 3次，經(jīng)酒精系列梯度脫水 (30%、40%、50%、70%、80%、90%、95%、95%、100%、100%)，室溫真空干燥，樣品噴金后，掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的粘附及鋪展情況。

1.6.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞粘附與增殖

將上皮細(xì)胞種植支架上，分別培養(yǎng)2 d、7 d、14 d的細(xì)胞支架培養(yǎng)物為實(shí)驗(yàn)組，未鋪加支架的 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (TCPS)為對(duì)照組。通過MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞粘附增殖情況：每孔加入MTT (0.5 mg/mL)溶液 40 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，小心棄去上清液，保留底部藍(lán)色結(jié)晶，每孔再加入400 μL二甲基亞砜 (DMSO)，吹打均勻，并對(duì)應(yīng)移至另一空96孔板，在490 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀 (MaxM5，Spectra)測(cè)定各孔的吸光度值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并測(cè)試3次，取平均值。

1.6.5 免疫熒光分析

細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，吸棄24孔板中的培養(yǎng)基，PBS清洗3次；4%多聚甲醛室溫固定30 min；0.1% Triton X-100破膜10 min，PBS清洗3次，每次10 min；羊血清室溫封閉1 h，吸干血清；加入一抗 CK14 (鼠抗人，按1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，每次10 min；異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的二抗 (羊抗鼠，按 1∶100稀釋)室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min；4',6'-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI，3 mg/mL)浸染10 min，PBS清洗3次，每次10 min。使用抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片，立即在激光共聚焦顯微鏡 (FV-1000，Olympus)下進(jìn)行熒光觀察及拍照。

1.6.6 Western blotting分析

細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次，用含有單去污劑 (PMSF)的蛋白裂解液(RIPA)抽提蛋白，冰上裂解30 min，將蛋白液吸至EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清。將25 μL蛋白提取液加入5%濃縮膠，電泳槽 (Mini-protean tetra system, Bio-RAD)接通電源，起始電壓80 V，待溴酚藍(lán)條帶進(jìn)入12%分離膠后調(diào)整電壓為100 V。電泳結(jié)束后，80 V恒定電壓轉(zhuǎn)膜1.5 h。隨后，把PVDF膜浸泡在含 5%脫脂奶粉的 TBS-T溶液中，室溫封閉1 h。將PVDF膜置于CK14角蛋白 (封閉液稀釋1∶200)溶液中，在搖床上室溫孵育1 h。TBS-T洗膜3次。然后將PVDF膜用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠-IGg二抗 (1∶2 000封閉液稀釋)室溫孵育1 h，洗膜。暗室中，底片曝光、顯影、定影，掃描成圖，利用Image J軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電紡支架的表征

2.1.1 支架的纖維特征

在靜電紡絲過程中，纖維形態(tài)的影響因素有很多，如溶液濃度、溶劑、電壓、接收距離、溶液流速、以及周圍環(huán)境等[17-20]。本文中所使用的電紡設(shè)備為本課題組自行研制、設(shè)計(jì)，在參考了以前的實(shí)驗(yàn)成果的基礎(chǔ)上[21-23]，通過不斷調(diào)整紡絲條件，并經(jīng)過光學(xué)顯微鏡對(duì)電紡纖維的觀察，確定最佳電紡絲參數(shù) (表1)。

高分子聚合物溶液通過靜電紡絲法制成纖維膜的有利條件是對(duì)纖維直徑的可控性。SEM觀察電紡纖維的表面形貌如圖 1所示，PLA和PLA/SF在上述紡絲條件下均形成了纖維，表面上也沒有明顯的液珠，纖維之間孔隙較大，連通性好，這樣的結(jié)構(gòu)在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)有利于營(yíng)養(yǎng)液的流通和代謝物的排出[24]。通過Image J軟件的分析，得到兩組支架的纖維直徑 (表2)，PLA和PLA/SF的纖維直徑均分布在200至400 nm之間，而且絲素蛋白的加入使電紡絲纖維的平均直徑明顯下降。

表1 PLA和PLA/SF電紡絲參數(shù)Table 1 Electrospinning parameters for PLA and PLA/SF scaffold

圖1 多孔纖維支架掃描電鏡圖Fig. 1 Scaffold morphology observed under SEM. (a)PLA. (b)PLA/SF.

表2 電紡絲支架的纖維直徑及力學(xué)性能參數(shù)Table 2 Quantitative results of scaffold’s diameter(nm)and mechanical properties

2.1.2 支架的力學(xué)性能

組織工程支架除了要給種子細(xì)胞提供足夠的生長(zhǎng)空間外，還要在細(xì)胞尚未形成組織之前，能為細(xì)胞提供一定的支撐且承受再生組織及周邊組織、器官及細(xì)胞等微環(huán)境帶來的張力；因此體外構(gòu)建的支架不僅要求具有一定的強(qiáng)度，還要具有一定的柔軟度，以利于細(xì)胞在其上進(jìn)行遷移運(yùn)動(dòng)。圖2為PLA、PLA/SF纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。支架的最大應(yīng)力 (ó)、最大應(yīng)變 (ε)及楊氏模量 (E)見表 2。PLA 纖維膜的最大應(yīng)力為(1.8±0.2)MPa，在應(yīng)變?yōu)?(11.2±1.2)%時(shí)出現(xiàn)屈服，有局部斷裂發(fā)生。PLA與 SF共紡所得的PLA/SF纖維膜的最大應(yīng)力為 (2.4±0.4)MPa，高于PLA。這是可以理解的，因?yàn)镾F本身具有很好的機(jī)械強(qiáng)度，素有生物鋼美稱，SF和PLA共紡所得纖維其機(jī)械強(qiáng)度也因此得到提升。另外，PLA/SF在達(dá)到最大應(yīng)變 (13.4±0.9)% 時(shí)發(fā)生斷裂。從上來看，PLA/SF的應(yīng)力和應(yīng)變與豬食道脫細(xì)胞后的粘膜及粘膜下層基質(zhì)的力學(xué)性能 (拉升應(yīng)力 (2±0.84)MPa)[25]相近。因此，我們認(rèn)為 PLA/SF電紡絲支架在力學(xué)性能上可以滿足作為構(gòu)建食道上皮的支架要求。

2.1.3 支架的降解性能

圖2 電紡支架材料的力學(xué)性能Fig. 2 Tensile stress-strain curve of electrospinning scaffolds. 1: PLA; 2: PLA/SF.

細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)的過程中，支架的降解速率必須與細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相吻合，過快或者過慢均會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[26-27]。支架的降解性主要取決于構(gòu)成支架的材料的降解性：對(duì)于聚合物來說，它的降解包括聚合物本身分子鏈逐漸斷裂而生成低聚物、低分子量降解產(chǎn)物甚至單體及低分子量降解產(chǎn)物所有的化學(xué)過程[28]。所以影響聚合物降解的因素有很多，如：聚合物本身的化學(xué)性質(zhì)如組成成分、分子鏈間的相互作用、材料的親/疏水性以及結(jié)構(gòu)參數(shù)如外形、結(jié)晶度、取向程度、表面結(jié)構(gòu)等[29-31]。實(shí)驗(yàn)證明，可降解聚合物在體內(nèi)、體外的降解規(guī)律具有很好的相似性，支架在體外的降解情況能為組織工程支架體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的降解情況提供參考依據(jù)[32-34]。本實(shí)驗(yàn)將支架浸于PBS (pH 7.4，相當(dāng)于生理鹽水)溶液中，以60 d為測(cè)試周期，檢測(cè)支架的質(zhì)量損失為計(jì)量指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)支架體外降解率，如圖 3所示。PLA/SF和PLA的降解趨勢(shì)非常接近，在7 d以前支架降解速率變化不甚明顯，在7～30 d之間，支架的 PLA降解速率急劇升到達(dá) 17.4%后又趨于平緩。但是降解率60 d時(shí)達(dá) (20.4±0.9)%，相較于之前Vieira等的研究稍有增大。他們發(fā)現(xiàn)從第2周開始，支架的質(zhì)量損耗就有大幅增加，達(dá)到20%左右[35]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

圖3 電紡支架PLA和PLA/SF的質(zhì)量損失隨時(shí)間的變化Fig. 3 Weight loss (%)of PLA and PLA/SF as a function of time. Scaffolds was immersed in PBS (pH 7.4)supplemented with 100 U/mL Penicillinstreptomycin at 37 ℃.

2.2 電紡支架的細(xì)胞相容性

組成上皮組織的上皮細(xì)胞是生長(zhǎng)在基膜上的復(fù)層未角化的鱗狀上皮細(xì)胞，呈連續(xù)性片狀構(gòu)造，而這一層基膜雖然只有幾十納米的厚度，卻對(duì)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及功能分化起著非常重要的作用。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)基膜是由IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白及蛋白聚糖等組成的納米纖維交織而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。為了提高高分子復(fù)合材料的生物相容性為了提高支架的相容性，很多研究工作是在人工支架上接枝膠原蛋白[36-39]，其中的Ⅳ型膠原蛋白起促使上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移至表皮形成粘膜層的作用。但是它僅僅是食道粘膜基層蛋白中的一種，因此我們從豬食道粘膜組織中提取了基膜的蛋白液，并將其包被于PLA的電紡絲纖維上，希望提高支架的上皮細(xì)胞相容性 (圖4)。檢測(cè)其上上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，同時(shí)將PLA和PLA/SF (圖1)作為對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基膜蛋白提取液接枝的PLA支架與空白PLA支架相比，纖維稍有變粗、鈍化，孔尺寸稍小，但是更加平滑。

圖4 coated-PLA支架掃描電鏡圖Fig. 4 SEM picture of coated-PLA scaffold.

上皮細(xì)胞是一種貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，其活性的不同與纖維支架中的纖維形態(tài)、結(jié)晶結(jié)構(gòu)以及化學(xué)組成相關(guān)[40]。因此我們可以通過檢測(cè) 3種支架上細(xì)胞的粘附及增殖能力的不同來評(píng)斷支架細(xì)胞相容性的優(yōu)劣。我們將豬F3上皮細(xì)胞分別種植于PLA、PLA/SF和 coated-PLA三種電紡絲支架上一定時(shí)間后對(duì)其細(xì)胞型貌和粘附增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。

從培養(yǎng)14 d的掃描電鏡圖可以看出上皮細(xì)胞在 3種支架上均有一定的粘附和增殖。但是在PLA支架上上皮細(xì)胞生長(zhǎng)密度較低，未連接成片 (圖5a，箭頭)；PLA/SF支架上上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況較PLA稍好 (圖5b)；coated-PLA支架上上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)密度不僅遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PLA、PLA/SF支架 (圖5c)，而且細(xì)胞與支架纖維融為一體連接細(xì)胞呈鋪路石狀緊密排列 (圖5c2)，與原代上皮細(xì)胞相同[41]，這樣支架更有利于細(xì)胞的粘附以及細(xì)胞間作用。

圖5 上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在支架上的掃描電鏡圖Fig. 5 Cell morphology observed under SEM. ECs were seeded on the scaffolds of PLA (a), PLA/SF (b)and coated-PLA (c). 1 and 2, different magnification. Cells were seeded at the density of 2.6′104 cells /cm2and cultured for 14 d at 37 ℃ in humidified air with 5% CO2 (The same conditions were followed for all cell culture).

上皮細(xì)胞本身緊密連接呈連續(xù)性片狀生長(zhǎng)，并被基底膜所支撐；而在離體培養(yǎng)時(shí)，通常比其他種類的細(xì)胞更難粘附于體外基底材料。在檢測(cè)上皮細(xì)胞線粒體活性隨時(shí)間變化的14 d中，我們以第2 天的細(xì)胞活性反映細(xì)胞在支架上的粘附率，PLA作為負(fù)對(duì)照，TCPS作為正對(duì)照。圖6顯示上皮細(xì)胞在PLA、PLA/SF、coated-PLA支架上的粘附率依次升高，雖然不及 TCPS，但是 coated-PLA支架上的細(xì)胞活性相較PLA支架提高了很多。在7 d及14 d時(shí)coated-PLA支架上的上皮細(xì)胞活性是3種支架中最好的，PLA/SF次之。這說明涂覆接枝在支架上的基膜蛋白提取液對(duì)上皮細(xì)胞具有明顯的支持作用，這可能是因?yàn)樘崛∮谑车赖幕さ鞍捉o細(xì)胞提供了一個(gè)類似于與體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境，大大促進(jìn)了上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。其次，來自于動(dòng)物體的絲素蛋白的存在也對(duì)提高支架的細(xì)胞相容性具有促進(jìn)作用，這些結(jié)果與 SEM所觀察到的結(jié)果也是一致的。

圖6 細(xì)胞活性隨時(shí)間的變化Fig. 6 Mitochondrial activity of epithelial cells as a function of culture time.

2.3 免疫組化分析

食道上皮層組織由里(靠近基膜)及外(內(nèi)腔)依細(xì)胞分化程度可以分為基底層、棘層及角質(zhì)層 3層。外層角質(zhì)層細(xì)胞高度分化呈多角形，其胞質(zhì)中含有大量角蛋白絲，具有很好的機(jī)械性能如耐磨、耐穿刺等，在不斷脫落的同時(shí)，自我修復(fù)能力也比較強(qiáng)。棘層細(xì)胞較肥大，胞漿較豐富。而基底層細(xì)胞屬新生上皮，細(xì)胞擁擠，體積圓潤(rùn)小巧，排列與鋪路石相似，分布于正常食管粘膜上皮基底層和基底旁細(xì)胞層，其功能是增殖分化以修補(bǔ)外兩層細(xì)胞的損失、脫落。從豬食道粘膜分離得到的上皮細(xì)胞呈現(xiàn)了鋪路石狀的上皮細(xì)胞型貌 (圖7a2，b2，c2)。

圖7 種植在支架上的上皮細(xì)胞CK14角蛋白免疫熒光圖Fig. 7 Immunofluorescences of epithelial cells seeded on scaffolds. Anti-keratin CK14 was used as the primary antibody. The nuclei were stained with DAPI to display blue (1)and the keratin was stained with anti-CK14 to display green (2). (3)is the composite of (1)and (2). (a)PLA, (b)PLA/SF and (c)coated-PLA.

角蛋白作為上皮細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)蛋白，是上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志性產(chǎn)物[42]。其中，CK14角蛋白僅在基底層上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)[43]，可以用來作為基底層上皮細(xì)胞的鑒定，其在胞質(zhì)中的含量是細(xì)胞增殖活力的一個(gè)評(píng)判指標(biāo)。細(xì)胞經(jīng)過14 d的培養(yǎng)，以單克隆抗體CK14免疫染色細(xì)胞質(zhì)，DAPI染細(xì)胞核，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖活力，其中藍(lán)色 (1)為細(xì)胞核，綠色 (2)為CK14蛋白染色，(3)是二者的復(fù)合。圖 7可以看出多數(shù)細(xì)胞均有少量CK14蛋白的表達(dá)，說明在支架上種植的細(xì)胞確為上皮細(xì)胞，且活性較好，分化未完全，具有很好的增殖能力。通過藍(lán)色細(xì)胞核的計(jì)數(shù)，各支架表面生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞密度由低到高依次為PLA (圖 7a)、PLA/SF (圖 7b)、coated-PLA (圖7c)。這一結(jié)果與MTT法測(cè)得的細(xì)胞增殖率結(jié)果一致。

圖8 Western blotting測(cè)定支架上細(xì)胞的CK14角蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig. 8 Relative quantification of CK14 expressed by epithelial cells cultured on different scaffolds using Western blotting technology. (a)The stripes from left to right represent the CK14 expression of cells on PLA,PLA/SF, coated-PLA scaffolds and TCPS, respectively.Cells were cultured in vitro for 14 d. (b)Quantitative analysis of CK14 (results were relatively percented by TCPS). P values less than 0.05 were considered to be significant.

運(yùn)用Western blotting技術(shù)對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞其 CK14角蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè) (圖 8)。由左至右的灰條帶分別代表 CK14角蛋白在PLA、PLA/SF、coated-PLA支架及 TCPS上的表達(dá)量 (圖8a)。條帶的顏色逐漸加深，表明蛋白量逐漸增加，PLA上細(xì)胞的 CK14角蛋白量最少，PLA/SF上次之，coated-PLA上細(xì)胞的CK14角蛋白是這3種支架中最多的。定量分析后 (圖8b)顯示，上皮細(xì)胞在coated-PLA支架上和在PLA/SF上表達(dá)的CK14角蛋白量均明顯比在 PLA支架上的表達(dá)量多。這說明細(xì)胞在coated-PLA和 PLA/SF兩種支架上的增殖能力強(qiáng)于PLA支架。

3 結(jié)論

我們以PLA為基材，利用靜電紡絲技術(shù)，模擬食道基膜結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了PLA及PLA/SF兩種納米纖維多孔支架。經(jīng)纖維形態(tài)、力學(xué)行為、降解等性能檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PLA/SF電紡纖維膜纖維結(jié)構(gòu)更趨近于基膜結(jié)構(gòu)，且機(jī)械性能更好；通過MTT、免疫熒光、Western blotting等方法檢測(cè)支架與上皮細(xì)胞的作用情況，表明PLA/SF具有與原代上皮細(xì)胞較好的相容性。從豬食道粘膜中提取基膜蛋白液并將其涂覆接枝于PLA支架纖維表面后，上皮細(xì)胞的粘附和增殖得到了明顯提高；而且體外培養(yǎng)14 d后仍然維持CK14蛋白的表達(dá)功能，我們認(rèn)為基膜蛋白的包被可以提供給體外培養(yǎng)的細(xì)胞以類似體內(nèi)的生長(zhǎng)微環(huán)境，有助于上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能分化。目前，我們正在嘗試將上皮組織的電紡絲纖維支架與肌組織的構(gòu)建相結(jié)合，為最終構(gòu)建出具有完善形狀和功能的組織工程化食道提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Pisani P, Parkin DM, Bray F, et al. Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990.Int J Cancer, 1999, 83(1): 18?29.

[2]Daly JM, Fry WA, Little AG, et al. Esophageal cancer: results of an American College of Surgeons patient care evaluation study. J Am Coll Surg, 2000, 190(5): 562?572.

[3]Enzinger PC, Mayer RJ. Esophageal cancer. N Engl J Med, 2003, 349(23): 2241?2252.

[4]Jung Y, Park MS, Lee JW, et al.Cartilageregeneration with highly-elastic three-dimensional scaffolds prepared from biodegradable poly (L-lactide-co-3-caprolactone).Biomaterials, 2008, 29(35): 4630?4636.

[5]Gundy S, Manning G, O’Connell E, et al. Human coronary artery smooth muscle cell response to a novel PLA textile/fibrin gel composite scaffold.Acta Biomater, 2008, 4(6): 1734?1744.

[6]Shum AW, Mak AF. Morphological and biomechanical characterization of poly (glycolic acid)scaffolds after in vitro degradation. Polym Degrad Stab, 2003, 81(1): 141?149.

[7]Kurella A, Dahotre NB. Review paper: surface modification for bioimplants: the role of laser surface engineering. J Biomater Appl, 2005,20(1): 5?50.

[8]Li LH, Ding S, Zhou CR. Preparation and biological evaluation of PLA/chitosan composite M aterials. J Biomed Eng, 2003, 20(3): 398?400(in Chinese).李立華, 丁珊, 周長(zhǎng)忍. 聚乳酸/殼聚糖多孔支架材料的生物學(xué)性能評(píng)價(jià). 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2003, 20(3): 398?400.

[9]Lazzeri L, Cascone MG, Danti S, et al.Gelatine/PLLA sponge-like scaffolds:morphological and biological characterization. J Mater Sci Mater Med, 2006, 17(12): 1211?1217.

[10]Cantón I, Mckean R, Charnley M, et al.Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnol Bioeng, 2010,105(2): 396?408.

[11]Cont L, Grant D, Scotchford C, et al. Composite PLA scaffolds reinforced with PDO fibers for tissue engineering. J Biomater Appl, 2011, 27(6):707–716.

[12]Chen L, Zhu YB, Li YY, et al. Progress and prospect of electrospun silk fibroin in construction of tissue-engineering scaffold. Chin J Biotech,2011, 27(6): 831?837 (in Chinese).陳玲, 竺亞斌, 李媛媛, 等. 絲素蛋白在電紡絲法構(gòu)建組織工程支架中的應(yīng)用進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27(6): 831?837.

[13]Servoli E, Maniglio D, Motta A, et al. Surface properties of silk fibroin films and their interaction with fibroblasts. Macromol Biosci,2005, 5(12): 1175?1183.

[14]Gil ES, Park SH, Marchant J, et al. Response of human corneal fibroblasts on silk film surface patterns. Macromol Biosci, 2010, 10(6): 664?673.

[15]Zhu YB. A electrospining device was applied to prepare porous nanfibers: China, 200810062323.8. 2008?10?08 (in Chinese).竺亞斌. 一種用于制備多空納米纖維的電紡裝置: 中國(guó), 200810062323. 8. 2008?10?08.

[16]Li Y, Zhu Y, Yu H, et al. Topographic characterization and protein quantification of esophageal basement membrane for scaffold design reference in tissue engineering. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2012, 100B(1):265?273.

[17]Pham QP, Sharma U, Mikos AG. Electrospun poly(ε-caprolactone)microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration.Biomacromolecules, 2006, 7(10): 2796?2805.

[18]Haghi A, Akbari M. Trends in electrospinning of natural nanofibers. Phys Status Solid A, 2007,204(6): 1830?1834.

[19]Chong E, Phan T, Lim I, et al. Evaluation of electrospun PCL/gelatin nanofibrous scaffold for wound healing and layered dermal reconstitution.ActaBiomater, 2007, 3(3): 321?330.

[20]Szentivanyi A, Chakradeo T, Zernetsch H, et al.Electrospun cellular microenvironments:Understanding controlled release and scaffold structure. Adv Drug Deliv Rev, 2011, 63(4):209?220.

[21]Zhu YB, Li YY, Liu YX. Fabrication of gelatin and polycaprolactonecomposite fibers using electrospinning technology. Chin J Ningbo Univ:Nat Sci Eng, 2009, 22(3): 408?413 (in Chinese).竺亞斌, 李媛媛, 劉玉新. 電紡絲復(fù)合纖維的制備及其影響因素探討. 寧波大學(xué)學(xué)報(bào): 理工版,2009, 22(3): 408?413.

[22]Zhu Y, Leong MF, Ong WF, et al. Esophageal epithelium regeneration on fibronectin grafted poly(L-lactide-co-caprolactone)(PLLC)nanofiber scaffold. Biomaterials, 2007, 28(5): 861?868.

[23]Zhu Y, Cao Y, Pan J, et al. Macro-alignment of electrospun fibers for vascular tissue engineering.J Biomed Mater Res B, Appl Biomater, 2009,92(2): 508?516.

[24]Li C, Vepari C, Jin HJ, et al. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering.Biomaterials, 2006, 27(16): 3115?3124.

[25]Yu JY, Zhu YB, Li YY, et al. Fabrication and mechanical properties of decellularized esophageal submucosal matrix. Chin J Biomed Eng, 2011, 30(2): 312?315 (in Chinese).俞 珺瑤, 竺亞斌, 李媛媛, 等. 食管粘膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及其力學(xué)性能. 中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào), 2011, 30(2): 312?315.

[26]Ma PX. Biomimetic materials for tissue engineering.Adv Drug Deliv Rev, 2008, 60(2): 184?198.

[27]Yixiang D, Yong T, Liao S, et al. Degradation of electrospun nanofiber scaffold by short wave length ultraviolet radiation treatment and its potential applications in tissue engineering. Tissue Eng A, 2008, 14(8): 1321?1329.

[28]G?pferich A. Mechanisms of polymer degradation and erosion. Biomaterials, 1996, 17(2): 103?114.

[29]Lee SJ, Yoo JJ, Lim GJ, et al. In vitro evaluation of electrospun nanofiber scaffolds for vascular graft application. J Biomed Mater Res A, 2007,83(4): 999?1008.

[30]Tan AR, Ifkovits JL, Baker BM, et al.Electrospinning of photo-crosslinked and degradable fibrous scaffolds. J Biomed Mater Res A, 2008, 87(4): 1034?1043.

[31]Jose MV, Thomas V, Johnson KT, et al. Aligned PLGA/HA nanofibrous nanocomposite scaffolds for bone tissue engineering. Acta Biomater, 2009,5(1): 305?315.

[32]Landes CA, Kriener S, Menzer M, et al.Resorbable plate osteosynthesis of dislocated or pathological mandibular fractures: a prospective clinical trial of two amorphous L-/DL-lactide copolymer 2-mm miniplate systems. Plast Reconst Surg, 2003, 111(2): 601?610.

[33]Suzuki T, Kawamura H, Kasahara T, et al.Resorbable poly-L-lactide plates and screws for the treatment of mandibular condylar process fractures: a clinical and radiologic follow-up study. J Oral Maxillofac Surg, 2004, 62(8):919?924.

[34]Eppley BL. Use of resorbable plates and screws in pediatric facial fractures. J Oral Maxillofac Surg,2005, 63(3): 385?391.

[35]Vieira A, Vieira J, Ferra J, et al. Mechanical study of PLA–PCL fibers during in vitro degradation. J Mech Behav Biomed Mater, 2011, 4(3): 451?460.

[36]Duan Y, Wang Z, Yan W, et al. Preparation of collagen-coated electrospunnanofibers by remote plasma treatment and their biological properties. J Biomater Sci Polym Ed, 2007, 18(9): 1153?1164.

[37]Zhu Y, Ong WF. Epithelium regeneration on collagen (IV)grafted polycaprolactone for esophageal tissue engineering. Mater Sci Eng C,2009, 29(3): 1046?1050.

[38]Chang KY, Hung LH, Chu I, et al. The application of type II collagen and chondroitin sulfate grafted PCL porous scaffold in cartilage tissue engineering. J Biomed Mater Res A, 2010, 92(2):712?723.

[39]Singh S, Wu BM, Dunn JCY. 2012. Delivery of VEGF using collagen-coated polycaprolactone scaffolds stimulates angiogenesis. J Biomed Mater Res A, 2012, 100A(3): 720?727.

[40]Yeo IS, Oh JE, Jeong L, et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds: preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponentnanofibrous structures.Biomacromolecules, 2008, 9(4): 1106?1116.

[41]Sarosiek J, McCallum RW. Mechanisms of oesophageal mucosal defence. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2000, 14(5): 701?717.

[42]Dale BA, Salonen J, Jones AH. New approaches and concepts in the study of differentiation of oral epithelia. Crit Rev Oral Biol Med, 1990, 1(3):167?190.

[43]Judd DA, Battista PJ, Behm DD. Culture of human keratinocytes in defined serum-free medium. Focus, 1997, 19(1): 2?5.