王薇，劉一葦，李宏濱

中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

準(zhǔn)確地把握生物大分子及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)是了解生命過程的基礎(chǔ)，對其三維結(jié)構(gòu)的解析，可給出大量的其本身及所屬體系的信息。該工作可大致分成以下4個環(huán)節(jié)：高純度大分子樣品的制備；晶體的獲得；結(jié)構(gòu)的解析；結(jié)構(gòu)信息指導(dǎo)下的生物學(xué)研究。在目前的技術(shù)條件下，樣品晶體的質(zhì)量是影響其結(jié)構(gòu)解析的主要原因[1-3]。影響生物大分子晶體及其復(fù)合物質(zhì)量的主要原因是分子的化學(xué)穩(wěn)定性及構(gòu)象一致性較差而得不到穩(wěn)定的復(fù)合物晶體。例如，在通常條件下，當(dāng)酶與底物發(fā)生反應(yīng)時，底物會被酶降解，所以不易清楚地看到底物和酶的結(jié)合情況。突變酶中關(guān)鍵基團(tuán)使酶失活以及選用底物類似物替代原有底物的的方法，經(jīng)常被用來捕捉酶和底物的結(jié)合，但由此方法獲得的結(jié)構(gòu)多為近似結(jié)構(gòu)。另外，在常溫條件下酶與底物的結(jié)合一般不太穩(wěn)定，這樣底物即便在失活酶中的位置也經(jīng)常不易確定。

我們在研究中發(fā)現(xiàn)[4-7]：在低溫 (?20 )℃條件下，分子構(gòu)象的一致性、分子間結(jié)合的穩(wěn)定性都會大大改善，一般酶的生物活性也會大幅度降低。由此獲得的酶-底物復(fù)合物更為穩(wěn)定，得到的晶體結(jié)構(gòu)衍射數(shù)據(jù)更趨于復(fù)合物結(jié)合時的實(shí)際結(jié)構(gòu)[8-9]。More等的研究也發(fā)現(xiàn)[10]，當(dāng)溫度由70 ℃降到?20 ℃時，β-葡萄糖苷酶的活性由100%降到 0.01%，也就是說在?20 ℃條件下，該酶基本失活?；谏鲜隹紤]，我們提出了“酶晶體低溫抑活底物固定”方法。該方法是在低溫環(huán)境下浸泡底物，此時酶基本失去活性，底物不易降解，而酶和底物結(jié)合的穩(wěn)定性卻大大提高，平衡后迅速進(jìn)行液氮固定，首先，可以獲得真實(shí)的酶-底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)；其次，可進(jìn)一步提高底物的占有率和空間穩(wěn)定性，提高底物電子密度的質(zhì)量。

為了進(jìn)行低溫浸泡試驗(yàn)[11]，我們選擇了 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (BglA)。根據(jù)催化底物分解時是否需要輔因子，BglA分兩類：糖基水解酶家族1 (Glycoside hydrolase family 1，GH1)和糖基水解酶家族4 (Glycoside hydrolase family 4，GH4)。GH4的 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在催化底物分解時需要金屬離子 (Mn2+、Ni2+、Co2+或Fe2+)和NAD+的輔助，同時需要一個還原性環(huán)境[12-15]，而GH1的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶則可以獨(dú)立完成催化作用[16-17]，其大小約50 kDa。BglA于1972年首次從產(chǎn)氣桿菌 Aerobacter aerogenes中被分離得到[18]，隨后1974年在大腸桿菌Escherichia coli中又再次被純化出來[19]。BglA能專一性地水解6-磷酸-β-葡萄糖苷鍵，可將底物對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸 (pNPβG6P)水解為對硝基苯酚和 6-磷酸-β-葡萄糖[20-21]。

1 材料與方法

1.1 材料

bglA基因 (EC31211186)由上海捷瑞生物工程有限公司合成；宿主桿菌主菌株 E. coli DH5α、E. coli BL21 (DE3)和載體 pET-28a由本室保存；SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所；His-TrapTMHP 5 mL購自于美國 GE公司；蛋白晶體篩選試劑 Crystal Screen HR2-110和 HR2-112購自美國 Hampton Research公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國 Pierce公司；底物 pNPβG6P 由美國 National Institutes of Health (NIH)的Dr. John Thompson提供。

1.2 BglA的表達(dá)

將構(gòu)建好的 pET-28a-bglA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，轉(zhuǎn)化成功的單克隆菌株置于20 mL LB 培養(yǎng)基中 (卡那霉素 5 μg/mL)，過夜培養(yǎng)后接種于2 L LB搖瓶，37 ℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到 0.6～0.8時，加入 IPTG至終濃度0.001 mol/L，37 ℃繼續(xù)振搖5 h，6 000 r/min離心10 min收集細(xì)菌。

1.3 BglA的提取與純化

收集的細(xì)菌用80 mL PBS (pH 7.4)重懸后，超聲波破碎裂菌，12 000 r/min離心10 min，收集上清。利用蠕動泵將上清液與His-Trap HP鎳柱過夜結(jié)合。采用快速蛋白液相色譜法，以緩沖液 A (20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，pH 8.0)和緩沖液 B (20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0)對結(jié)合有蛋白的鎳柱進(jìn)行梯度洗脫，并進(jìn)行蛋白峰收集及SDS-PAGE檢測。收集到的蛋白在超濾濃縮管中置換成分子篩緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，pH 8.0)，經(jīng) Superdex 200凝膠層析柱進(jìn)一步純化，蛋白峰收集并再次進(jìn)行SDS-PAGE檢測。BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度。

1.4 蛋白晶體的生長

蛋白晶體的培養(yǎng)采用懸滴式蒸氣擴(kuò)散法，篩選試劑來源于 Crystal Screen HR2-110和HR2-112試劑盒。將1 μL蛋白溶液與1 μL池液混勻，同200 μL的池液進(jìn)行氣相平衡，靜置于16 ℃環(huán)境生長。

1.5 常溫試驗(yàn)

首先，準(zhǔn)備晶體板，并制備防凍液。防凍液成分：1 μL 50% (V/V)甘油，2 μL 池液 (0.1 mol/L N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸鈉鹽 (HEPES sodium)，pH 7.5，10% (V/V)異丙醇和 20%聚乙二醇4 000 (Polyethylene glycol 4 000)(W/V))。制備好的防凍液放入晶體板。用尼龍環(huán)挑取BglA蛋白晶體，放入防凍液中，加入3 μL 20 mmol/L底物 pNPβG6P。用尼龍環(huán)挑出蛋白晶體與底物復(fù)合物，放入液氮固定。

1.6 低溫試驗(yàn)

準(zhǔn)備低溫晶體板，用水將含有甘油的紙條潤濕，再將坐滴孔內(nèi)加滿水，蓋上玻璃蓋，以保持環(huán)境的濕度；制備防凍液，成分為：1 μL 50%(V/V)甘油，2 μL 池液(0.1 mol/L N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸鈉鹽 (HEPES sodium)，pH 7.5，10% (V/V)異丙醇和 20%聚乙二醇 4 000(Polyethylene glycol 4 000)(W/V))。制備好的防凍液放入晶體板。之后用尼龍環(huán)挑取出BglA蛋白晶體，放入防凍液中，迅速置于?20 ℃低溫冰箱中。靜置 10 min后，迅速取出蛋白晶體板，快速加入3 μL 20 mmol/L底物pNPβG6P。再次將晶體板放回?20 ℃低溫冰箱中。靜置10 min后迅速取出晶體板，用尼龍環(huán)挑出蛋白晶體與底物復(fù)合物，放入液氮固定。

2 結(jié)果

2.1 BglA的表達(dá)與純化結(jié)果

為了有效地純化蛋白，在設(shè)計(jì) bglA重組序列時，在C末端多加了1段由6個組氨酸構(gòu)成的His-tag。攜帶重組質(zhì)粒 pET-28a-bglA的 E. coli BL21在37 ℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)大量可溶性BglA蛋白，分子量大小約50 kDa。

利用組氨酸標(biāo)簽和咪唑的相互作用，通過His-Trap層析柱梯度洗脫，在40 mmol/L咪唑濃度及 60 mmol/L濃度附近獲得濃度較高的蛋白(圖 1)。收集到的蛋白在超濾濃縮管中置換成分子篩緩沖液，經(jīng)Superdex 200凝膠層析柱，BglA進(jìn)一步被純化 (圖 2)，隨后用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，蛋白濃度高達(dá)8 mg/mL。

圖1 BglA鎳柱親和層析之后電泳結(jié)果圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of BglA after purified with a His-Trap HP column. M: protein marker. The collected fractions of BglA corresponding to the SDS-PAGE lanes 1,2,3.

圖2 BglA凝膠過濾層析之后電泳結(jié)果圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of BglA after purified with a Superdex 200 10/300 column. M: protein marker. The collected fraction of BglA corresponding to the SDS-PAGE lane 1.

2.2 晶體生長結(jié)果

晶體的生長條件篩選選用Hampton Research的Crystal Screen的HR2-110和HR2-112試劑盒，共98個不同條件的池液，每個池液含有緩沖液，沉淀劑和鹽3類成分。觀察發(fā)現(xiàn)有幾個不同的條件均生長出了晶體，其中在池液成分為0.1 mol/L HEPES sodium (pH 7.5)、10% (V/V)2-propanol、20% (W/V)PEG 4 000的生長條件下，經(jīng)過2周的時間，生長出了能夠達(dá)到X射線衍射條件的晶體 (圖 3)。

2.3 數(shù)據(jù)收集、處理結(jié)果及底物電子密度圖

圖3 在某一條件下得到的蛋白晶體Fig. 3 Crystals of BglA. The crystals of BglA grown at 16 ℃, and the longest dimension of the crystals is 290 μm.

表1 BglA晶體衍射數(shù)據(jù)Table 1 Data collection and refinement statistics

在?20 ℃的低溫條件下，利用“酶晶體低溫抑活底物固定”方法，將BglA晶體與底物進(jìn)行浸泡，并用液氮固定，通過X射線進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)收集并處理，獲得了完整的底物電子密度圖。BglA晶體衍射數(shù)據(jù)的空間群屬于P212121，最高分辨率為2 ?，結(jié)構(gòu)采用分子置換法解析。數(shù)據(jù)收集和優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表1所示。在利用“酶晶體低溫抑活底物固定”方法進(jìn)行低溫試驗(yàn)前，我們選用前期生長良好的BglA晶體，使用常規(guī)方法，進(jìn)行了酶與底物浸泡的對比試驗(yàn)。所用晶體的空間群屬于I222，晶胞參數(shù)為a=69.441 ?，b=86.902 ?，c=161.765 ?，最高分辨率為 2.4 ?，結(jié)構(gòu)采用分子置換法解析。經(jīng)優(yōu)化處理后得到了水解底物的電子密度圖。通過對比的衍射電子密度圖顯示，底物pNPβG6P在經(jīng)低溫處理的BglA晶體結(jié)構(gòu)中有完整的電子密度；對于未經(jīng)低溫處理的BglA晶體，底物在相應(yīng)位置已經(jīng)被水解(圖 4)。

3 討論

3.1 低溫防凍劑配方的選擇

在利用“酶晶體低溫抑活底物固定”方法進(jìn)行低溫試驗(yàn)時，選用甘油作為主防凍劑，但當(dāng)用尼龍環(huán)挑出單顆晶體放入防凍劑之后，晶體出現(xiàn)了迅速融化的現(xiàn)象。之后，我們對此環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，嘗試放入多顆晶體，以使溶液達(dá)到飽和狀態(tài)。在放入第1顆晶體時，晶體依然很快融化；繼續(xù)放入第2顆，晶體只是部分開裂；放入第3顆晶體后，該晶體完好。另外，我們也嘗試將晶體加入不含甘油的池液，晶體并未開裂或融化，但經(jīng)過?20 ℃低溫處理后，再次觀察發(fā)現(xiàn)晶體部分開裂，用尼龍環(huán)挑晶體時出現(xiàn)了斷裂現(xiàn)象，說明此時的晶體脆性增強(qiáng)，防凍劑的保護(hù)不可或缺。因此，找到適合各種溫度的多體系低溫防凍劑配方，使晶體不易開裂并可以承受更深的低溫是我們需要進(jìn)一步解決的問題。

3.2 “酶晶體低溫抑活底物固定”方法對底物電子密度的影響

圖4 不同條件下獲得的底物電子密度圖Fig. 4 Comparison between the electron density of bound substrates from two methods. 2Fo-Fc electron density map is contoured at 1.0 σ, the left shows that the substrate was hyzrolyzed at normal temperature, the right shows that the electron-density of the substrate was intact at ?20 ℃.

本研究使用的“酶晶體低溫抑活底物固定”方法，是在?20 ℃條件下將 BglA晶體與pNPβG6P進(jìn)行浸泡，通過X射線收集衍射數(shù)據(jù)并處理，最終獲得了完整的底物電子密度圖。與常規(guī)方法相比較，使用的底物相同，但取得的效果卻差別明顯。我們認(rèn)為，用常規(guī)方法無法獲得完整的底物電子密度，因?yàn)橐话忝冈诔Ｒ?guī)溫度下都能夠迅速水解底物，而“酶晶體低溫抑活底物固定”方法是在保持天然結(jié)構(gòu)的狀態(tài)下，將酶活力降低到幾乎失活的水平，延緩底物的水解。另外在低溫狀態(tài)下，pNPβG6P的 β糖苷鍵的柔性會降低，使得硝基苯基團(tuán)的位置更固定，也有利于取得較好的電子密度。

3.3 低溫酶學(xué)及復(fù)合物中間態(tài)的進(jìn)一步研究

為了進(jìn)一步試驗(yàn)“酶晶體低溫抑活底物固定”方法在低溫酶學(xué)研究領(lǐng)域的普適性，在獲得了BglA與其底物復(fù)合物的實(shí)際結(jié)構(gòu)后，我們還利用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的酰亞胺酶 (Imidase)與其特異性底物進(jìn)行了浸泡試驗(yàn)，獲得了比較完整的底物電子密度圖。由于復(fù)合物晶體的衍射數(shù)據(jù)低于3 ?，我們正在進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化篩選，以期獲得優(yōu)于3 ?的數(shù)據(jù)結(jié)果，進(jìn)而得到理想的底物電子密度圖。另外，我們也正在選擇其他的酶與底物進(jìn)行低溫浸泡試驗(yàn)，進(jìn)一步擴(kuò)大復(fù)合物中間態(tài)的研究范圍。

3.4 低溫條件下的單晶生長

從“酶晶體低溫抑活底物固定法”自然派生出的一個思路便是研究深低溫條件下生物大分子單晶生長的技術(shù)。如前所述，在深低溫條件下生物大分子有著更好的化學(xué)穩(wěn)定性和構(gòu)象一致性，有望得到分辨率更高的晶體。目前，我們已經(jīng)利用溶菌酶在?20 ℃低溫環(huán)境下進(jìn)行晶體生長實(shí)驗(yàn)，以不同濃度 DMSO替代甘油作為主防凍劑進(jìn)行梯度試驗(yàn)，獲得了生長良好的晶體，并得到了較高分辨率的衍射數(shù)據(jù)。

[1]Heras B, Martin JL. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2005,61(9): 1173?1180.

[2]Abergel C. Spectacular improvement of X-ray diffraction through fast desiccation of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004,60(8): 1413?1416.

[3]Su D, Lou ZY, Sun F, et al. Dodecamer structure of severe acute respiratory syndrome coronavirus nonstructural protein nsp10. J Virol, 2006, 80(16):7902?7908.

[4]Liu Y, Xiong Y, Naidenko OV, et al. The crystal structure of a TL/CD8αα complex at 2.1 ? resolution-implications for modulation of T cell activation and memory. Immunity, 2003, 18:205?215.

[5]Bowman GD, O'Donnell M, Kuriyan J. Structural analysis of a eukaryotic sliding DNA clamp-clamp loader complex. Nature, 2004, 429(6993):724?730.

[6]Mi Y, Wood G, Thoma L. Cryoprotection mechanisms of polyethylene glycols on lactate dehydrogenase during freeze-thawing. AAPS J,2004, 6(3): e22.

[7]Dobrianov I, Kriminski S, Caylor CL, et al.Dynamic response of tetragonal lysozyme crystals to changes in relative humidity: implications for post-growth crystal treatments. Acta Cryst Crystallogr D Biol Crystallogr, 2001, 57(1):61?68.

[8]Kuo A, Bowler MW, Zimmer J, et al. Increasing the diffraction limit and internal order of a membrane protein crystal by dehydration. J Struct Biol, 2003, 141: 97?102.

[9]Ellis MJ, Antonyuk S, Hasnain SS. Resolution improvement from `in situ annealing' of copper nitrite reductase crystals. Acta Cryst Crystallogr D Biol Crystallogr, 58: 456?458.

[10]More N, Daniel RM, Petach HH. The effect of low temperatures on enzyme activity. J Biochem, 1995,305(1): 17?20.

[11]Liu WD. Structural analysis of hydroxyquinol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida DLL-E4 and crystallographic study on two pesticide degradation related enzymes [D].Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2010 (in Chinese).劉衛(wèi)東. Pseudomonas putida DLL-E4 1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶的晶體結(jié)構(gòu)及兩種農(nóng)藥降解相關(guān)酶的蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究[D]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[12]Raasch C, Streit W, Schanzer J, et al. Thermotoga maritima AglA, an extremely thermostable NAD+-,Mn2+-, and thiol-dependent alpha-glucosidase.Extremophiles, 2000, 4(4): 189?200.

[13]Robrish SA, Fales HM, Gentry-Weeks C, et al.Phosphoenolpyruvate-dependent maltose:phosphotransferase activity in Fusobacterium mortiferum ATCC 25557: specificity,inducibility, and product analysis. J Bacteriol,1994, 176(11): 3250?3256.

[14]Suresh C, Rus'd AA, Kitaoka M, et al. Evidence that the putative alpha-glucosidase of Thermotoga maritima MSB8 is a pNP alpha-D-glucuronopyranoside hydrolyzing alpha-glucuronidase.FEBS Lett, 2002, 517(1/3): 159?162.

[15]Thompson J, Gentry-Weeks CR, Nguyen NY, et al.Purification from Fusobacterium mortiferum ATCC 25557 of a 6-phosphoryl-O-alpha-D-glucopyranosyl: 6-phosphoglucohydrolase that hydrolyzes maltose 6-phosphate and related phospho-alpha-D-glucosides. J Bacteriol, 1995,177(9): 2505?2512.

[16]Thompson J, Robrish SA, Bouma CL, et al.Phospho-beta-glucosidase from Fusobacterium mortiferum : purification, cloning, and inactivation by 6-phosphoglucono-delta-lactone. J Bacteriol,1997, 179(5): 1636?1645.

[17]Thompson J, Ruvinov SB, Freedberg DI, et al.Cellobiose-6-phosphate hydrolase (CelF)of Escherichia coli : characterization and assignment to the unusual family 4 of glycosylhydrolases. J Bacteriol, 1999, 181(23): 7339?7345.

[18]Palmer RE, Anderson RL. Cellobiose metabolism in Aerobacter aerogenes 3. Cleavage of cellobiose monophosphate by a phospho-β-glucosidase. J Biol Chem, 1972, 247(11): 3420?3423.

[19]Wilson G, Fox CF. The beta-glucoside system of Escherichia coli IV. Purification and properties of phospho-beta-glucosidases A and B. J Biol Chem,1974, 249(17): 5586?5598.

[20]Yin J, Liu YW, Li J, et al. Cloning, expression,crystallization and characterization of a novel 6-phospho-β-glucosidase from Thermoanaerobacter tengcongensis. Chin J Biochem Mol Biol, 2008,24(10): 916?924 (in Chinese).尹捷, 劉一葦, 李潔, 等. 騰沖嗜熱厭氧桿菌 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的表達(dá)與結(jié)晶及其功能鑒定.生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2008, 24(10): 916?924.

[21]Totir M, Echols N, Nanao M, et al. Macro-to-micro structural proteomics: native source proteins for high-throughput crystallization. PLoS ONE, 2012,7(2): e32498.