黃忠輝，滕偉，陳盈，王琴梅

1 中山大學附屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點實驗室，廣東 廣州 510080

2 中山大學附屬光華口腔醫(yī)院，廣東 廣州 510080

血管新生是指在已有血管結構基礎上，形成新血管網(wǎng)的生物過程。血管新生的機理比較復雜，諸多促進新生的因素中包括血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)等的調(diào)控作用[1]。通過基因治療的方法來調(diào)控 VEGF和bFGF的水平，具有作用特異性強、不良反應輕等優(yōu)點[2-3]，在臨床上有重大的研究和應用意義。

然而，目前的基因治療研究多集中于提高報告基因體外轉染癌細胞的效率[4-6]，對治療基因進行體內(nèi)實驗的研究較少。我們已證實氧化海藻酸接枝低分子量聚乙烯亞胺 (Alginategraft-PEI，Alg-g-PEI)(圖 1)能在體外介導VEGF質粒 (pVEGF)轉入大鼠骨髓間充質干細胞 (Rat mesenchymal stem cells, rMSCs)，表達出有效治療劑量的VEGF，同時表現(xiàn)出較低的細胞毒性。在此基礎上，本研究通過模擬體內(nèi)條件驗證 Alg-g-PEI能否有效保護 DNA，并以雞胚和斑馬魚為動物模型，進一步探索Alg-g-PEI/pVEGF復合物在體內(nèi)促進血管新生的作用，為該載體下一步的大動物實驗及未來的臨床應用提供理論和實踐依據(jù)。

圖1 Alg-g-PEI的化學結構[7]Fig. 1 Chemical structure of Alg-g-PEI[7].

1 材料與方法

1.1 材料

Alg-g-PEI：本實驗室自制，分子量17 000 Da，氮含量 23.3%；血管內(nèi)皮生長因子真核表達質粒 (pVEGF)受贈于廣東省人民醫(yī)院；胎牛血清購自Hyclone公司；Alamar Blue購自廣州國奧生物有限公司；5日齡受精種蛋購自華南農(nóng)業(yè)大學畜牧研究所；甲基纖維素 (Methyl cellulose,MC, 188042)購自 Sigma公司；血管熒光轉基因斑馬魚 (Flk-1)由中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實驗室惠贈；斑馬魚培養(yǎng)液 (Holtbuffer)的配方(1 L)：NaCl 3.5 g；KCl 0.05 g；NaHCO30.025 g；CaCl20.1 g，加入雙蒸水充分溶解。

凝膠電泳儀 (電泳儀DYY-6C型)；凝膠圖像分析儀 (GAS7001X，UVITEC)；雞胚孵化箱(型號HH.B11.260-TBS，上海躍進醫(yī)療器械廠)；體視顯微鏡 (Nikon AZ100)。

1.2 方法

1.2.1 復合物的制備

將pVEGF稀釋至40 ng/μL，根據(jù)所需N/P配制不同濃度的Alg-g-PEI或PEI 25K水溶液，pVEGF與Alg-g-PEI或PEI 25K等體積混合后渦旋 3～5 s，室溫靜置 30 min，自組裝形成Alg-g-PEI/pVEGF復合物，立即使用。

1.2.2 細胞毒性檢測

常規(guī)分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞(rMSCs)[8]。在有血清 (10%)條件下，使用Alamar Blue法[9-10]測定 N/P分別為 60、90、110的Alg-g-PEI/pVEGF復合物對rMSCs的毒性，復合物在培養(yǎng)基中所占體積分數(shù)為10%。以PEI 25K/pVEGF (N/P=10)為陽性對照，無復合物干預的細胞存活率為100%對結果進行標準化，計算細胞存活率 (n=3)。

1.2.3 Alg-g-PEI/pVEGF復合物耐肝素置換能力

制備濃度分別為 10、12、16、18、20、50 mg/mL的肝素水溶液各10 μL，分別加入10 μL Alg-g-PEI與pVEGF質粒DNA形成的復合物 (Alg-g-PEI/pVEGF, N/P=60)溶液，共孵育15 min或2 h 后，取樣行凝膠電泳分析[7]。

1.2.4 Alg-g-PEI/pVEGF復合物耐 DNaseⅠ酶降解作用

取8 μL Alg-g-PEI與pVEGF質粒DNA形成的復合物 (Alg-g-PEI/pVEGF，N/P=60)溶液，與2 μL 1 U DNaseⅠ或PBS混合，37 ℃孵育0.25、0.5、2、4、8、12、24 h (加 PBS 的孔僅孵育 6 h)后，加入 5 μL 100 mmol/L EDTA，37 ℃孵育10 min使DNase I酶失活，再加入10 μL 12 mg/mL肝素溶液，室溫孵育 2 h使pVEGF和 Alg-g-PEI充分解離，取樣進行凝膠電泳分析，以未經(jīng)酶處理的裸pVEGF、DNase I處理的裸pVEGF為對照。

1.2.5 Alg-g-PEI/pVEGF復合物耐血清能力

取10 μL Alg-g-PEI與pVEGF質粒DNA形成的復合物 (Alg-g-PEI/pVEGF，N/P=60、90、110)溶液，分別與等體積新鮮血清 (50%)混合，37 ℃孵育3、6、12、24、48 h后，加入10 μL 12 mg/mL肝素溶液，室溫孵育2 h后，取樣進行凝膠電泳分析，以裸、血清同樣處理的裸pVEGF、未加血清但同樣孵育處理的復合物為對照。

1.2.6 Alg-g-PEI/pVEGF復合物促進 CAM 血管生成作用

配制5%的甲基纖維素 (MC)水溶液，高壓蒸汽滅菌后，將 160 μL 溶液分 4次 (50、50、30、30 μL)加入 96 孔板中，每次加完后在 (60±3)℃的烘箱中烘1 h，最后從96孔板中小心挑出MC膜，置于紫外燈下照射30 min滅菌，備用。

參考賀國安等[11]的方法培養(yǎng)雞胚種蛋，在(38±0.5)℃、濕度40%～70%的孵化箱中孵育到第 7天，選擇發(fā)育正常的雞胚開窗。將雞胚隨機分為9組： PEI 25K/pVEGF (N/P=10)陽性對照組、生理鹽水空白對照組、N/P=90的空載體對照組、0.4 μg的裸 pVEGF對照組，Alg-g-PEI/pVEGF (N/P=90)中分別含 0.4、0.8、1.2、1.6、2.4 μg DNA的實驗組。雞胚開窗揭去氣室膜暴露CAM，將MC膜置于CAM 中央血管稀少區(qū)，再將 50 μL樣品溶液分別用移液槍滴加到 MC膜里，用無菌的透明膠帶封貼氣室端。繼續(xù)常規(guī)孵育72 h后，于膜表面加入3～5 mL冰冷的固定液 (甲醇和丙酮等體積混合)固定30 min，用眼科剪小心剪下整塊血管膜，在盛有固定液的培養(yǎng)皿中小心攤開，使膜平貼于培養(yǎng)皿表面，置于體視顯微鏡下觀察和拍照。照片使用image-pro plus 6.0分析軟件進行處理[12]，以加樣位置為中心建立一個20×20 cm2的固定選區(qū)，對選區(qū)內(nèi)的血管面積進行計算，最后計算血管面積和CAM選區(qū)面積的比值 (VA/CAM)[13]。

1.2.7 復合物對斑馬魚的毒性及促血管生成作用

按標準方法養(yǎng)殖和繁殖斑馬魚[14-15]，將健康成熟的斑馬魚按雌雄 1/2的比例放入交配魚缸中，次日搜集受精魚卵。

將健康的新生受精魚卵置于24孔板中，每孔30個，加入1 mL Holtbuffer。24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，再分別加入N/P為45、60、90、110的Alg-g-PEI/pVEGF復合物水溶液100 μL，以PEI 25K/pVEGF (N/P=10)為陽性對照，未處理的受精魚卵為空白對照。共孵育一定時間后，評價其毒性和促血管生成作用。

毒性實驗：對復合物干預后的斑馬魚觀察96 h (隔6 h一次)，記錄死亡例數(shù)和時間。使用Graphpad Prism 5.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，作Kaplan-Meier生長曲線，與陽性對照組比較，記錄P值。

促血管生成實驗：在72 h后 (干預后48 h)將斑馬魚用 10%多聚甲醛固定后，置于體視顯微鏡下觀察腸下血管新生情況，拍照后使用NIH Image 圖像處理軟件對腸下血管面積和長度進行定量分析[16-17]。

1.2.8 結果處理

如無特別說明，所有結果均取 3次實驗平均值，應用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (x±s)表示，組間比較采用t檢驗，**P＜0.01和*P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞毒性檢測

Alg-g-PEI/pVEGF復合物水溶液在有血清條件下對rMSCs毒性很低 (圖 2)，細胞存活率均在80%以上；當N/P=60、90時，Alg-g-PEI/pVEGF復合物與細胞接觸4 h后基本無毒性，48 h后細胞存活率仍然高于 80%，分別為(84.61±3.15)%和 (82.62±1.97)%，大于陽性對照組 (26.03±4.06)%(**P＜0.01)；當 N/P=110時，隨著孵育時間的增加細胞存活率下降，但48 h后存活率仍保持 (72.39±2.84)%，而陽性對照組的細胞存活率一直低于50%。

2.2 Alg-g-PEI對pVEGF的保護作用

圖2 rMSCs和聚合物/pVEGF復合物在有血清 (10%)條件下共孵育后的細胞存活率 (與 PEI 25K 組相比**P＜0.01)Fig. 2 Cell viability of rMSCs after incubation with polymer/pVEGF complexes in 10% serum. **P<0.01 vs PEI 25K group.

肝素競爭置換實驗結果表明，肝素濃度為12 mg/mL時，孵育 15 min能夠置換出部分pVEGF，孵育2 h后能完全置換出pVEGF (圖3A)。而10 mg/mL的肝素孵育2 h后仍不能完全置換出pVEGF。復合物耐DNase I酶解實驗顯示，裸VEGF與酶接觸0.5 h后已完全降解，而Alg-g-PEI和pVEGF復合后，當酶解時間小于 4 h時，肝素置換出的 DNA條帶與未處理pVEGF條帶的亮度接近；酶解時間大于4 h，部分pVEGF被酶解，置換后的條帶亮度下降，條帶不清晰 (圖3B)。在耐血清實驗中，裸pVEGF和血清共孵育3 h后部分被降解，6 h后完全降解 (圖 3C，泳道 2)。相比之下，有 Alg-g-PEI保護的pVEGF能夠在48 h內(nèi)免受血清的降解，肝素置換pVEGF后，電泳條帶的亮度、形狀與裸DNA接近，48 h后N/P=110、90的復合物仍能很好地保護ppVEGF (圖 3C)。

2.3 Alg-g-PEI/pVEGF復合物促進 CAM 血管生成作用

如圖 4所示，在顯微鏡下可觀察到實驗組血管 (圖 4C)比空白對照組(圖 4A)和陽性對照組 (圖4B)多，表現(xiàn)為分支增多，血管密度和直徑增大。空白組的血管保持正常CAM的葉脈狀自然生長，血管整體分布均勻。陽性對照組的血管較實驗組的稀疏，但比空白組密。定量計算結果 (表1)表明，實驗組VA/CAM為44.4%，明顯高于陽性對照組 (35.9%)和空白對照組(24.03%)(**P＜0.01)，且具有劑量依賴性。

2.4 復合物對斑馬魚的毒性及促血管生成作用

圖3 Alg-g-PEI/pDNA在不同溶液中孵育一定時間后對pDNA的保護能力 (A為耐肝素競爭置換，B為耐DNaseⅠ酶解，C為耐血清降解：1、2、3泳道分別是裸pVEGF、pVEGF和50%血清共孵育、Alg-g-PEI/pVEGF和PBS共孵育)Fig. 3 Protection of Alg-g-PEI to pVEGF against pVEGF heparin (HEP)(A), DNase I (B)and serum (50%)(C).1: naked pVEGF; 2: pVEGF incubated with serum (50%); 3: Alg-g-PEI/pVEGF incubated with PBS.

圖4 Alginate-Graft-PEI/pVEGF復合物對CAM血管新生的影響 (A為空白對照組，B為PEI 25K組(N/P=10，DNA含量為2.4 μg)，C為Alg-g-PEI/pVEGF復合物組 (N/P=90，DNA含量為2.4 μg))Fig. 4 Effect of Alginate-Graft-PEI/pVEGF on angiogenesis of chick embryo chorioallantoic membrane. (A)Blank group. (B)CAM treated by PEI 25K containing 2.4 μg DNA (N/P=10). (C)CAM treated by Alg-g-PEI/pVEGF complexes containing 2.4 μg DNA (N/P=90).

表1 不同樣品處理后的CAM血管面積 (VA/CAM,x±s)Table 1 Vessel area in CAM treate by different samples (VA/CAM,x±s)

圖5 不同氮磷比Alg-g-PEI/pVEGF復合物與斑馬魚胚胎共培養(yǎng)的Kaplan-Meier生長曲線Fig. 5 Kaplan-Meier survival curves of zebrafish embryos after incubation with Alg-g-PEI/pVEGF complexes at various N/P ratios. P-value vs PEI/pVEGF at N/P=10.

如圖 5所示，在所研究范圍內(nèi)，Alg-g-PEI/pVEGF對斑馬魚受精卵基本無毒性。當 N/P＜110，斑馬魚生存曲線平穩(wěn)，96 h 后斑馬魚的生存率均在 75%以上，毒性明顯低于 PEI 25K/pVEGF (N/P=10)，且差異顯著。而N/P=110時，毒性較大，96 h后的生存百分率低于60%(圖5D)。在促斑馬魚血管生成實驗中，在顯微鏡下可觀察到 Alg-g-PEI組 (圖 6C～F)血管分支明顯多于空白對照組 (圖6A)和PEI 25K對照組 (圖6B)，且腸下血管整體較長、血管面積較大。Alg-g-PEI組和PEI組均見釘突樣血管新生現(xiàn)象 (圖 6箭頭處)，空白組血管保持正常生長，整體分布均勻 (圖 6A)。對腸下血管面積和血管整體長度進行計算后作圖 (圖 6G，H)，發(fā)現(xiàn)Alg-g-PEI組與空白對照組和陽性對照組相比較均有顯著性差異 (**P＜0.01，*P＜0.05)，當N/P=110時，血管總長度和面積分別為1.11 mm和 1.70×103像素；N/P=90時，為 1.01 mm 和1.65×103像素；均明顯大于 PEI 25K 對照組(0.82 mm、1.11×103像素)(**P＜0.01)。

圖6 不同氮磷比Alg-g-PEI/pVEGF復合物對斑馬魚血管生成作用的定性 (C～F)與定量 (G，H)分析 (A、B分別為空白對照組和PEI 25K/pVEGF (N/P=10)陽性對照組，白色箭頭處為釘突樣血管，**P＜0.01，*P＜0.05)Fig. 6 Effects of Alg-g-PEI/pVEGF on the angiogenesis of zebrafish embryos at various N/P ratios (C–F). (A)Nontreated zebrafish. (B)Zebrafish treated with PEI 25K/pVEGF (N/P=10). Quantization of length and area of subintestinal vessels (G, H)in zebrafish embryos. White arrows are vessels assembling spikes. **P<0.01; *P<0.05.

3 討論

基因載體是基因治療中不可缺少的一部分，病毒載體因為不易大批量生產(chǎn)、DNA裝載量少、安全性不高等原因并沒有得到廣泛的臨床應用[18]。鑒于基因治療的無限潛能，人們將注意力轉到陽離子非病毒載體，但與病毒載體相比，陽離子聚合物轉染效率較低，因此如何提高轉染效率并降低毒性成為急需解決的問題。本課題組用低分子量的 PEI 1.8K和可降解的氧化海藻酸鈉接枝，合成出 Alg-g-PEI，體外轉染實驗表明它對不同細胞均有較高轉染效率和較低的細胞毒性[7]。為了探索Alg-g-PEI在體內(nèi)條件下是否依然具備低毒性和高轉染能力，本研究模擬體內(nèi)條件，先考察了 Alg-g-PEI/pVEGF復合物對rMSCs的毒性，結果顯示復合物在有血清條件下對 rMSCs基本無毒性 (圖 2)。當 N/P＜110時，復合物與rMSCs孵育48 h后，細胞仍然具有較高存活率 (大于 80%)，明顯高于 PEI 25K (**P＜0.01)，初步證明Alg-g-PEI在體內(nèi)有血清條件下轉染的安全性。體內(nèi)轉染時，陰離子多糖對 pDNA的競爭置換及體內(nèi)血清中非特異性酶、內(nèi)切酶等對外源DNA的降解是轉染的主要障礙，因此體內(nèi)轉染要求載體/pDNA復合物具有穩(wěn)定性，能夠有效保護pDNA在傳遞過程中以及到達靶細胞之后免遭核酸酶等的降解[19-20]。本研究以VEGF質粒作為實驗DNA，通過耐肝素陰離子置換、耐 DNaseⅠ酶和血清實驗考查Alg-g-PEI對 DNA的保護作用，結果表明，pVEGF與Alg-g-PEI復合后，肝素 (12 mg/mL)需要2 h完全置換pVEGF (圖3A)；DNaseⅠ酶需要24 h完全降解p pVEGF (圖3B)；血清則在48 h內(nèi)仍不能完全降解pVEGF (圖3C)，而無保護的pVEGF在0.5 h就已被DNase I酶解完全；6 h被血清降解完全。說明Alg-g-PEI/pVEGF對pVEGF具有較好保護作用，預示了 Alg-g-PEI體內(nèi)轉染的可行性。

本研究選擇 CAM 模型作為體內(nèi)轉染促進血管生成的模型，主要因為CAM操作性強、可信度高、實驗結果易于觀察、指標明確、結果易于定量，適合促血管生成藥物高通量初篩[21-22]。我們選擇7 d的雞胚進行開窗加樣，是因為CAM血管網(wǎng)絡在這個時期形成的速度比較穩(wěn)定，雞胚生命力旺盛，CAM 血管發(fā)育穩(wěn)定[23]；雞胚早期免疫系統(tǒng)發(fā)育不全，對所加測試藥物無強烈排斥反應[21]，對實驗結果影響較小。選擇MC膜作為載藥模具，是因其質地光滑、質量輕、生物相容性好、48 h左右降解消失，與濾紙片、瓊脂糖片及塑料蓋玻片相比較，具有較大優(yōu)勢[24-25]。

在前期研究中，我們先固定pVEGF用量為1.2 μg，考察不同N/P比復合物對CAM血管生成的促進作用，結果發(fā)現(xiàn)N/P=90時，復合物具有最佳促進血管生成作用，然后固定N/P=90，觀察血管生成的pVEGF劑量的依賴性。結果發(fā)現(xiàn)當pVEGF用量為2.4 μg/CAM時，促血管生成作用最明顯，VA/CAM為44.4%，高于陽性對照組 (35.9%)和空白對照組 (24.03%)。說明 Alg-g-PEI在體內(nèi)環(huán)境下能夠成功將目的基因導入到細胞里，并表達出能夠促進局部血管生成的蛋白量，且蛋白量可通過劑量調(diào)控。

為進一步驗證 Alg-g-PEI/pVEGF在體內(nèi)的安全性和有效性，我們考察了 Alg-g-PEI對Flk-1斑馬魚胚胎的毒性和血管新生的促進作用。與大鼠等模型相比，斑馬魚具有與人類在血管發(fā)育過程中的基因及信號通路有高度同源性、成本低適合高通量篩選、易于觀察、指標容易定量等特點，被廣泛應用于血管發(fā)生機制研究及促血管新生相關藥物的篩選[26]。斑馬魚的Kaplan-Meier生存曲線結果 (圖 5)顯示，當N/P=45、60、90，Alg-g-PEI/pVEGF幾乎不影響斑馬魚的存活與發(fā)育，斑馬魚生存百分率 75%以上，與PEI 25K/pVEGF對照組相比*P＜0.05，說明體內(nèi)應用時Alg-g-PEI/pVEGF具有低毒性。

因斑馬魚腸下血管由血管新生形成，且易操作、易定量，我們通過定性觀察和定量計算斑馬魚腸下血管長度、面積來探討Alg-g-PEI/pVEGF復合物對斑馬魚血管新生的促進作用。一般斑馬魚腸下血管呈籃子形狀，從體節(jié)的腹部邊緣往卵黃方向延伸，橫向長約 50～100 μm[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，Alg-g-PEI/pVEGF有效地促進了斑馬魚腸下血管新生，主要表現(xiàn)在：腸下血管網(wǎng)在體節(jié)方向延長超過150 μm；血管網(wǎng)整體面積增大；血管的直徑增大、分支增多；血管籃子底部有釘突樣血管生成 (圖 6箭頭處)。這說明VEGF得到了有效表達，斑馬魚實驗再一次證明了 Alg-g-PEI/pVEGF具有較低的毒性，并且能促進體內(nèi)血管生成。

總之，本研究通過系列實驗證明了Alg-g-PEI與pVEGF復合后對rMSCs和斑馬魚都具有較低的毒性，且能有效保護 pDNA。Alg-g-PEI能介導 pVEGF在組織細胞內(nèi)表達出治療量的VEGF，促進血管生成。預示Alg-g-PEI作為一種基因載體具有較好的應用前景和開發(fā)潛力，我們將進一步研究Alg-g-PEI的轉染機制以及在大動物體內(nèi)促血管生成的量效、時效關系，為將來的臨床應用提供更加充分的理論和實踐依據(jù)。

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