顏冰希 ，余姍姍，馮 曉，吳冬玲，蔡昕筱，周倩沁，何曉敏，陳愛嫩，張大勇

(1.浙江大學城市學院醫(yī)學院，浙江 杭州 310015;2.杭州市第二人民醫(yī)院，浙江 杭州 310015)

干細胞具有自我更新及多向分化能力，對機體穩(wěn)態(tài)的維持和器官損傷的修復(fù)具有重要作用［1］。但干細胞和體內(nèi)其他細胞一樣，也會衰老，衰老干細胞增殖及分化能力減弱［2-3］。MSCs(mesenchymal stem cells，MSCs)可分化為中胚層的各種細胞且經(jīng)誘導能向神經(jīng)外胚層分化，是臨床細胞移植重要的種子細胞來源［4-5］，但MSCs 也存在衰老現(xiàn)象，老年MSCs 移植治療效果不佳，延緩MSCs 衰老是其研究熱點之一［6-7］。我們前期研究提示，老年MSCs 數(shù)量少，活力低，體外培養(yǎng)困難［8］，因此，構(gòu)建穩(wěn)定的MSCs 衰老模型，體外模擬MSCs 衰老對MSCs 衰老研究具有重要意義。D-半乳糖(Dgalactose，D-gal)是一種生理性營養(yǎng)成分，在細胞內(nèi)通過醛糖還原酶的代謝可轉(zhuǎn)化為半乳糖醇，半乳糖醇不能在細胞內(nèi)代謝，產(chǎn)生后即在細胞內(nèi)堆積，提高細胞氧化應(yīng)激壓力［9］。研究表明，D-gal 在動物模型(大鼠、小鼠和果蠅)上具有顯著的致衰老作用，而且有復(fù)制方法簡單、耗時短等優(yōu)點，已作為致老劑被廣泛應(yīng)用［10-12］。但D-gal 對干細胞衰老的研究還較少，尤其是其對干細胞衰老的影響機制尚不清楚，這些均限制了D-gal 在干細胞衰老研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。本試驗采用不同濃度D-gal 培養(yǎng)MSCs，觀察其對MSCs 衰老、增殖、存活和氧化應(yīng)激水平的影響，探討不同濃度D-gal 誘導MSCs 衰老過程的作用及其機理，以期明確體外構(gòu)建MSCs衰老實驗?zāi)Ｐ偷淖钸mD-gal 濃度，為探討干細胞衰老提供重要的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 7 日齡Spragus Dawley(SD)乳鼠由浙江省醫(yī)學科學院提供(動物合格證號:SCXK(浙)2008-0033)。

1.2 主要試劑 DMEM(美國Hyclone 公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程有限公司)，PBS 液，HBSS 液(美國Hyclone 公司)，胰蛋白酶(美國Hyclone 公司)，β-半乳糖苷酶檢測試劑盒(南通碧云天生物技術(shù)有限公司)，AO/EB 染色液(南京凱基生物技術(shù)公司)，黃嘌呤氧化酶測試盒(南京建成生物工程研究所)。主要的抗體:p21、p16 一抗和HRP-標記的鼠及兔二抗購自Santa Cruz 公司，p53 和β-actin 一抗購自BD 生物科技公司。

1.3 SD 大鼠MSCs 體外培養(yǎng) 拉頸處死SD乳鼠(7 日齡)，剪去腹壁，用碘酒、75%乙醇擦拭后肢皮毛，取出乳鼠雙側(cè)股骨和脛骨，清除周圍的肌肉和韌帶，并用HBSS 液清洗3次，切除骨兩端的干骺端，暴露骨髓腔，用含有8%肝鈉素(500 IU/ml)的PBS 液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心(1000 r/min，8 min)。用含15%FBS、584 mg/L 谷氨酰胺、105 IU/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液混懸沉淀細胞。以5×105個/ml 的細胞密度均勻接種到25 ml 的培養(yǎng)瓶中，在37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后換液除去懸浮細胞，以后每3 d 換液1次，待細胞生長至80%融合時進行傳代。后續(xù)試驗均選用3～4 代的MSCs。

1.4 實驗處理 在1.3 的基礎(chǔ)上，各組MSCs吸去原培養(yǎng)液后，經(jīng)PBS 液清洗3 遍，并進行不同的試驗處理:①對照組，不含D-gal 的DMEM 培養(yǎng)液。②誘導組:用含1 g/L、10 g/L、50 g/L D-gal 的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)MSCs。每組MSCs 取自6 只SD 乳鼠，各組均培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)檢測。

1.5 各組MSCs 衰老檢測(衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色法) MSCs 接種到培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，當細胞生長至80%融合時，隨機分為4組(處理方法見1.4)，之后PBS 液清洗3次，4%多聚甲醛固定5 min 后，用酸性液(pH 6.0)清洗細胞2次。加入適量的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal)染色液，37℃下孵育12 h。在相差顯微鏡下隨機選擇3個視野，計數(shù)每100個細胞中陽性細胞的數(shù)目，每組實驗重復(fù)5次。

1.6 各組MSCs 存活能力檢測(AO/EB 染色法) 將MSCs 接種到培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，當細胞生長至80%融合時，各組進行相應(yīng)處理(方法同上)，之后用PBS 清洗3次，加入AO/EB 染料30 min，混合均勻，PBS 清洗3次。熒光顯微鏡下，可見4 種細胞形態(tài):①活細胞(VN)，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu);②早期凋亡細胞(VA)，核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀;③晚期凋亡細胞(NVA)，核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀;④死亡細胞(NVN)，核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)。細胞凋亡率由以下公式計算:細胞凋亡率=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA +NVA)×100%，每組實驗重復(fù)5次。

1.7 各組MSCs 增殖檢測 取對數(shù)生長期MSCs 制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至3×104/ml，將細胞懸液接種于96 孔板中，每孔接種0.1 ml。各組分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 和7 d(期間每3d 換液1次)，每天培養(yǎng)結(jié)束后各孔加入5 mg/ml 的MTT 孵育4 h，然后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150μl 的DMSO，震蕩10 min 后，酶標儀上讀取波長為570 nm 的吸光度值，繪制細胞增殖曲線。每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.8 各組MSCs 內(nèi)氧化應(yīng)激水平檢測 總SOD(T-SOD)活力的測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA 的測定采用硫代巴比妥酸法。各組細胞培養(yǎng)結(jié)束后，消化細胞，超聲破碎收集細胞裂解液，后續(xù)具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。

1.9 Western blot 法檢測細胞內(nèi)p53，p21 和p16 表達 各組細胞處理結(jié)束后，RIPA 裂解液提取經(jīng)處理的細胞總蛋白，冰浴30min 裂解混勻、4℃12 000 r/min 離心30 min 后，BCA 法測定總蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h 后，p53，p21 和p16或β-actin 一抗(1∶500～1∶1000 稀釋)4℃孵育過夜，TPBS 洗膜，結(jié)合辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000 稀釋)，TPBS 洗膜，采用ECL 化學發(fā)光法檢測蛋白的表達。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，各組間的差別采用單因素方差分析進行比較。首先采用F 檢驗進行方差齊性檢驗，P ＞0.05 認為方差齊，而后兩兩比較采用q 檢驗，當P＜0.05 時表示差異具有顯著性。

2 試驗結(jié)果

2.1 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色結(jié)果 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色顯示，在對照組中僅見少量細胞呈β-半乳糖苷酶染色陽性，而1 g/L D-gal、10 g/L D-gal、50 g/L D-gal 這3組β-半乳糖苷酶陽性細胞體積變大，形態(tài)扁平，10 g/L D-gal、50 g/L D-gal 兩組陽性細胞數(shù)較多(圖1A)。細胞計數(shù)結(jié)果表明，對照組β-半乳糖苷酶陽性細胞數(shù)目為(20.8±4.9)個/100 細胞，1 g/l D-gal、10 g/l D-gal、50 g/l D-gal 誘導組β-半乳糖苷酶陽性細胞數(shù)目依次為為(27.6±6.0)、(59.6±10.0)、(69.8±11.8)個/100 細胞，其中10 g/l D-gal、50 g/l D-gal組較對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，n=5)，說明在上述兩組濃度下D-gal 可促進MSCs衰老(圖1B)。

圖1 D-gal 促進MSCs 衰老Fig.1 Effects of D-gal on MSCs aging

2.2 Western blot 法檢測衰老相關(guān)蛋白表達結(jié)果 為進一步明確D-gal 對MSCs 衰老的作用，我們檢測了D-gal 對衰老相關(guān)蛋白p53，p21 和p16 表達的影響。結(jié)果顯示，隨D-gal 處理濃度增高，MSCs 內(nèi)p53、p21 和p16 表達逐漸增加(圖2)。

圖2 D-gal 促進MSCs 內(nèi)p53、p21 和p16 表達Fig.2 D-gal can increase the p53，p21 and p16 expression in MSCs

2.3 AO/EB 雙染檢測MSCs 凋亡結(jié)果 AO/EB 雙染結(jié)果顯示，對照組細胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯的細胞凋亡情況，1 g/L 和10 g/L D-gal組MSCs 僅有少量細胞表現(xiàn)出凋亡細胞的形態(tài)學表現(xiàn)，凋亡細胞出現(xiàn)細胞形態(tài)皺縮、染色體聚集、細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)出現(xiàn)紅染等表現(xiàn)，大部分細胞形態(tài)正常;而50 g/L D-gal組的MSCs 出現(xiàn)明顯的凋亡和壞死變化(圖3A)。凋亡率計數(shù)結(jié)果顯示，1 g、10 g、50 g/L D-gal 誘導組細胞的凋亡 率 依次 為19.7%±4.6%、24.6%±8.5%、51.2%±9.9%，其中50 g/L D-gal組與對照組(11.9%±3.0%)的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，提示50 g/L D-gal 可以明顯導致MSCs 凋亡、壞死(圖3B)。

2.4 MTT 法檢測MSCs 增殖結(jié)果 MTT 法檢測MSCs 的增殖能力，結(jié)果表明培養(yǎng)第5～7天，10 g/L、50 g/L D-gal 誘導組的吸光度值較對照組降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明上述兩組的細胞增殖能力較對照組有下降，表明D-gal 處理可抑制MSCs 的增殖能力(圖4)。

圖3 高濃度D-gal 可誘導MSCs 凋亡Fig.3 High-concentration D-gal can induce MSCs apoptosis

圖4 D-gal 抑制MSCs 增殖Fig.4 D-gal can inhibit the proliferation of MSCs

2.5 D-gal 對MSCs 內(nèi)氧化水平影響檢測結(jié)果對照組SOD 活力為(35.1±7.2)U/mgprot，1、10、50 g/L D-gal 誘導組SOD 活力分別為(28.3±5.8)、(14.6±3.7)、(11.6±2.8)U/mgprot，檢測結(jié)果表明SOD 活力隨D-gal 濃度增高而逐漸降低;其中，10、50 g/L D-gal組的SOD 較對照組明顯減少，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖5A)。對照組MDA 含 量為(8.7±2.5)mmol/mgprot，1、10、50 g/L D-gal 誘導組的MDA 含 量 為(14.6±4.4)、(27.5±5.4)、(29.9±6.2)mmol/mgprot，結(jié)果說明MDA 活力隨D-gal 濃度增高而逐漸升高，其中10 g/L、50 g/L D-gal組的MDA 與對照組的差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，n=5)。這些結(jié)果提示D-gal 可以促使MSCs 內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高(圖5B)。

3 討論

當前，干細胞移植已成為臨床治療疾病的重要手段，研究表明，MSCs 在機體穩(wěn)態(tài)維持和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，并已被廣泛應(yīng)用于干細胞移植治療中［5］。然而，MSCs 也存在衰老現(xiàn)象，事實證明老年個體接受干細胞治療的效果普遍不如年輕個體，嚴重影響了其移植療效［6］。因此，延緩MSCs 衰老已成為干細胞衰老研究的熱點，但目前，老年MSCs 由于其數(shù)量少，活性低，體外培養(yǎng)具有一定難度，嚴重影響了MSCs 的衰老研究進展。因此，體外人為構(gòu)建穩(wěn)定可靠的MSCs 衰老模型，具有重要的基礎(chǔ)研究意義。

D-gal 誘導的衰老動物模型是目前國內(nèi)常用的衰老誘導模型，具有復(fù)制方法簡單、耗時短等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛用于個體衰老的機制以及延緩衰老藥物篩選等研究中，但其在體外誘導細胞衰老中的研究仍較少，邢玉芝等研究了D-gal對MSCs 衰老的影響［13］，但未能明確D-gal 對MSCs 衰老相關(guān)蛋白表達及其存活能力的影響，這些都是細胞衰老鑒定的重要指標，同時D-gal誘導細胞衰老的作用機制也不明確。本實驗通過檢測不同濃度D-gal 誘導MSCs 衰老后，其衰老相關(guān)蛋白表達及其增殖、凋亡情況的改變，確定D-gal 誘導MSCs 衰老的最適濃度，并初步探討D-gal 抑制細胞衰老的可能機理，為MSCs 衰老研究提供良好的體外模型。

圖5 SOD、MDA 含量檢測結(jié)果Fig.5 Effects of D-gal on SOD/MDA

3.1 不同濃度D-gal 對MSCs 衰老和凋亡的影響 本實驗β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示，D-gal誘導下，10 g/L、50 g/L D-gal 誘導組的陽性細胞數(shù)目顯著高于對照組(P＜0.01)，并呈現(xiàn)體積變大、形態(tài)扁平等衰老形態(tài)，且隨D-gal 處理濃度提高，細胞內(nèi)衰老相關(guān)蛋白p53，p21 和p16 表達逐漸增加，表明D-gal 體外誘導細胞衰老的作用依然存在，但低濃度(1 g/L組)作用不明顯。在AO/EB 雙染法結(jié)果表明，低濃度D-gal 可對MSCs 凋亡無明顯影響;而高濃度Dgal(50 g/L)可誘導50%以上的MSCs 發(fā)生晚期凋亡或壞死，對細胞造成了很強損傷，不利于構(gòu)建穩(wěn)定的細胞衰老模型。邢玉芝等［13］也從MTT 檢測中發(fā)現(xiàn)，8 g/L 的D-gal 處理MSCs，能夠?qū)е缕湓鲋衬芰档?而隨著濃度的增加，16 g/L 的D-gal 處理后細胞呈負增長。因此，我們認為，10 g/L D-gal 具有良好的MSCs 衰老誘導作用，且可抑制細胞正常的增殖和存活能力;但50 g/L 濃度下，D-gal 的細胞損傷作用明顯增強，故10 g/L 是D-gal 進行誘導MSCs 衰老的合適濃度。

3.2 D-gal 誘導MSCs 衰老的作用機制 細胞衰老的同時，常伴隨著細胞內(nèi)活性氧成分的增多［14］，我們前期研究也表面氧化應(yīng)激水平升高是促進MSCs 衰老的重要原因［7］。SOD 是重要的抗氧化酶，可以清除細胞中過多的氧自由基，其活力可反映出細胞的抗衰老能力;如果SOD活力下降，多余的自由基就作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的MDA，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細胞毒性。MDA 含量能證明細胞內(nèi)過氧化物質(zhì)的水平。本研究結(jié)果顯示，D-gal 可使細胞內(nèi)SOD 的活力下降，而MDA 含量升高，且與濃度成正相關(guān)。由此我們推測，D-gal 可能通過氧化應(yīng)激作用提高細胞的過氧化水平來促進細胞衰老，從而抑制其增殖分化，促進細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高可能是D-gal 在體外促進細胞衰老的作用機制之一。

綜上，我們采用D-gal 誘導MSCs 細胞形態(tài)、數(shù)量和增殖能力的改變，結(jié)果提示，D-gal 體外構(gòu)建MSCs 衰老模型的合適濃度是10 g/L，并揭示促進細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高可能是D-gal 誘導細胞衰老的作用機制，為進一步研究MSCs 衰老及其機理提供了可靠且有價值的實驗數(shù)據(jù)。

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