葉淑雅，李向榮，邵盈盈

(1.浙江大學城市學院醫(yī)學院，浙江 杭州 310015;2.浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州 310006;3.浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

肝損傷過程大多與氧化應激和免疫有關，化學物質(zhì)、藥物、酒精等能直接或間接誘導肝細胞生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，干擾細胞內(nèi)的能量代謝，活化細胞死亡程序等，最終以轉氨酶升高為表現(xiàn)形式造成不同程度的肝功能失常。CCl4誘導的肝損傷模型是評價肝損傷藥物療效的標準模型。CCl4是一種毒性很強的化學物質(zhì)，進入體內(nèi)后，經(jīng)肝細胞微粒體細胞色素P-450 激活，生成活潑的三氯甲基自由基(·CCl3)、氯自由基(Cl-)以及三氯甲基過氧化自由基(CCl3O2)，這些自由基攻擊肝臟細胞膜上的磷脂分子，再與膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子進行共價結合，影響蛋白質(zhì)代謝，并且破壞膜結構和功能的完整性，胞漿鈣離子濃度升高，最終導致肝細胞胞漿中的可溶性酶滲出，引起一系列血液生化指標的改變。

紫心甘薯系旋花科藤蔓性多年生草本植物甘薯(Ipomoera batatas)的干燥塊莖，是甘薯的一個新品種。紫心甘薯不同于一般的甘薯品種，它含有大量的黃酮類化合物［1］，紫心甘薯含有的黃酮類化合物穩(wěn)定性高，對熱、光、酸比較穩(wěn)定［2-3］。近年來，國內(nèi)外研究表明，紫心甘薯總黃酮提取物具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、預防心腦血管疾病、調(diào)節(jié)血糖、抑菌等多種藥理作用［4-12］，但紫心甘薯總黃酮對肝臟損傷的保護作用未見報道。本實驗通過研究紫心甘薯總黃酮提取物對四氯化碳誘導的急性肝損傷小鼠的影響，探討其保護肝臟的作用及機制，為進一步開發(fā)和利用紫心甘薯提供理論和實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康ICR 小鼠60 只，雌雄各半，體重18～20 g，清潔級，由浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合格證號SCXK(浙)2008-0033;實驗過程中小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，保持動物房溫度(22±2)℃，相對濕度(60±5)%，燈光控制12 h 晝夜交替，自由攝食和飲水。

1.2 儀器與試劑 儀器:XS105 型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);KQ-700DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);臺式高速冷凍離心機Allegra 64R(美國貝克曼庫爾特實驗有限公司);Tissue LyserⅡ-Qiegn 型勻漿機(RETSCH產(chǎn)品);XW80A 漩渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠);TECAN 型酶標分析儀(SUNRIS 產(chǎn)品)。

試劑:谷草轉氨酶(AST)試劑盒、谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、考馬斯亮蘭總蛋白定量測試盒等均購自南京建成生物工程研究所;聯(lián)苯雙酯滴丸(BPD)購自北京協(xié)和藥廠(批號:10070104);其它試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 紫心甘薯總黃酮提取物的制備 紫心甘薯烘干粉碎后，將粉末置于燒杯中，用20 倍量體積分數(shù)為70%的乙醇在60℃下超聲提取35 min，固定超聲電功率為560 W，超聲頻率為40 kHz，經(jīng)超聲提取后，抽濾，棄去固體殘渣，濾液旋轉蒸發(fā)后，揮干乙醇，濃縮備用，總黃酮含量為50 mg·ml-1。

2.2 動物分組及處理 ICR 小鼠60 只，動物房適應性喂養(yǎng)7 d 后，按體重隨機分為6組，每組10 只，分為:空白組(正常組)、CCl4模型組、紫心甘薯總黃酮組(高、中、低劑量分別為400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1)和陽性對照組(聯(lián)苯雙酯150 mg·kg-1)。正常組與模型組給予等量體積的生理鹽水灌胃，灌胃10 d。于末次給藥后1 h，除正常對照組腹腔注射10 ml·kg-1的花生油外，其余各組均腹腔注射體積分數(shù)0.1%CCl4花生油溶液10 ml·kg-1，禁食，不禁水。

2.3 指標檢測 16 h 后，摘取小鼠眼球取血約0.5 ml，置于1.5 ml 離心管中，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層血清，測定谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和乳酸脫氫酶。頸椎脫臼法處死小鼠，分別取肝臟和脾臟，用4℃生理鹽水漂洗，濾紙吸干血水，稱重，計算肝臟、脾臟指數(shù)。觀察肝臟和脾臟的變化。取相同部位的肝組織0.2 g，放入離心管中，加預冷生理鹽水1.8 ml，將肝組織剪碎，加入鋼珠，開啟組織研磨儀10 min，制成10 g·ml-1肝勻漿，檢測肝組織中超氧化物歧化酶和丙二醛含量。血清和肝臟中AST、ALT、LDH、SOD、MDA 的測定，均按試劑盒說明書進行。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計分析軟件，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差()表示，以one-way ANOVA 分析各組之間的差異;若具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，則采用LSD 分析后檢驗進行統(tǒng)計分析，肝、脾指數(shù)與血清和肝臟中各指標的相關性采用Pearson correlation 相關分析，檢驗水準均為α=0.05。

3 實驗結果

3.1 紫心甘薯總黃酮提取物對肝損傷小鼠臟器指數(shù)的結果 與空白組相比，模型組中臟器指數(shù)顯著升高，其中肝臟指數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)，脾臟指數(shù)有極顯著性差異(P＜0.01)，說明小鼠CCl4誘導的急性肝損傷模型建立成功;與模型組相比，紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組中肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著降低(P＜0.05);與空白組相比，紫心甘薯總黃酮100 mg·kg-1組小鼠的肝臟指數(shù)差異顯著(P＜0.05)，紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組小鼠的脾臟指數(shù)均有顯著性差異(P＜0.05)。結果見表1。

表1 紫心甘薯總黃酮對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of PSPF on organ index in mice(，n=10)

表1 紫心甘薯總黃酮對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of PSPF on organ index in mice(，n=10)

#:與空白組比較，P＜0.05;* :與模型組比較P＜0.05;＊＊:與模型組比較，P＜0.01;＊＊:與空白組比較，P＜0.01.

3.2 紫心甘薯總黃酮提取物對肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和LDH 的結果 實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析表明:與空白組相比，模型組小鼠血清中AST、ALT 和LDH 活性明顯升高，其中AST 水平有顯著性差異(P＜0.05)，ALT 和LDH 水平有極顯著性差異(P＜0.01)，表明損傷程度顯著，即小鼠CCl4誘導的急性肝損傷模型建立成功;與模型組比較，聯(lián)苯雙酯陽性藥物組中AST的水平有顯著性差異(P＜0.05)，ALT 和LDH的水平均有極顯著性差異(P＜0.01)，紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組中AST、ALT 的水平均有顯著性差異(P＜0.05)，LDH 的水平均有極顯著性差異(P＜0.01);與空白組相比，紫心甘薯總黃酮200 mg·kg-1組小鼠血清中的LDH 的差異顯著(P＜0.05)，紫心甘薯總黃酮100 mg·kg-1組小鼠血清中的LDH 水平有極顯著性差異(P＜0.01)。見表2。

表2 藥物等對小鼠血清中AST、ALT 和LDH 的影響Table 2 Effect of drugs on the level of AST，ALT and LDH in serum(，n=10)

表2 藥物等對小鼠血清中AST、ALT 和LDH 的影響Table 2 Effect of drugs on the level of AST，ALT and LDH in serum(，n=10)

#:與空白組比較，P＜0.05;* :與模型組比較，P＜0.05;＊＊:與模型組比較，P＜0.01;##:與空白組比較，P＜0.01.

3.3 紫心甘薯總黃酮提取物對肝損傷小鼠肝組織中SOD 和MDA 含量的結果 與空白組相比，模型組的SOD 含量有極顯著性降低(P＜0.01)，MDA 含量極顯著升高(P＜0.01)，表明小鼠CCl4誘導的急性肝損傷模型建立成功;各給藥組與模型組比較，聯(lián)苯雙酯陽性藥物組及紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組小鼠肝組織中SOD 的水平和MDA 的含量均有極顯著性差異(P＜0.01);與空白組相比，聯(lián)苯雙酯陽性藥物組及紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組小鼠肝組織中MDA 的含量均有極顯著性差異(P＜0.01)，且紫心甘薯總黃酮400 mg·kg-1、200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組SOD 含量和MDA 含量存在量效關系。見表3。

表3 藥物等對小鼠肝組織中SOD 和MDA 的影響Table 3 Effect of drugs on the activity of SOD and the content of MDA in hepatic tissue(，n=10)

表3 藥物等對小鼠肝組織中SOD 和MDA 的影響Table 3 Effect of drugs on the activity of SOD and the content of MDA in hepatic tissue(，n=10)

#:與空白組比較，P＜0.05;* :與模型組比較，P＜0.05;＊＊:與模型組比較，P＜0.01;##:與空白組比較，P＜0.01.

4 討論

本實驗采用0.1% CCl4花生油溶液建立小鼠急性肝損傷模型，實驗結果表明，預先給予紫心甘薯總黃酮提取物的小鼠，經(jīng)CCl4造模后，與模型組相比肝重指數(shù)和脾重指數(shù)相對減少，血清中的AST 與ALT 活性顯著降低，且LDH的水平也呈現(xiàn)下降，提示紫心甘薯總黃酮對CCl4誘導的肝細胞損傷有明顯保護作用。與聯(lián)苯雙酯化學藥相比較，紫心甘薯總黃酮具有無毒副作用的優(yōu)點。

SOD 是細胞內(nèi)主要的防御性抗氧化酶，能夠清除自由基，并可抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化反應，從而起到保護細胞膜結構和功能的完整作用。實驗結果得出給藥組小鼠肝組織勻漿中的SOD 活性高于模型組，且400 mg·kg-1組的增加程度較200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組明顯，呈現(xiàn)出正相關性，表明肝細胞的抗氧化能力增強，可以抵御肝細胞的氧化應激和過氧化，使肝細胞免受損傷。

MDA 是機體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，并因此形成脂質(zhì)過氧化物。MDA 是脂質(zhì)過氧化反應過程中的最終產(chǎn)物，具有很強的生物毒性，可嚴重破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹、壞死，其含量直接反映了組織氧化損傷的程度。實驗中各給藥組小鼠肝組織內(nèi)MDA 含量明顯低于模型組，表明紫心甘薯總黃酮可對抗CCl4所致的肝臟脂質(zhì)過氧化反應，減輕CCl4對肝細胞的損害。并且400 mg·kg-1組MDA 含量的降低程度較200 mg·kg-1和100 mg·kg-1組明顯，呈現(xiàn)出正相關性。

綜上所述，本實驗結果表明紫心甘薯總黃酮對CCl4誘導的肝損傷具有明顯的保護作用，其機制可能與清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化有關。本實驗研究結果為紫心甘薯開發(fā)成為肝損傷的輔助治療藥物提供一定的科學依據(jù)和實驗基礎。

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