沈 薔，章海敏，胡軍祥

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300)

目前全世界魚(yú)類共有2.1 萬(wàn)余種，在9 000 余種淡水魚(yú)類中，已有2%的種類滅絕;我國(guó)是一個(gè)水生生物資源豐富的國(guó)家，據(jù)統(tǒng)計(jì)大約有3 862種魚(yú)類，其中淡水魚(yú)類約有1 050種［1］，豐富的種質(zhì)資源與遺傳多樣性為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。但是，近年來(lái)，魚(yú)類棲息環(huán)境污染、過(guò)度捕撈、水域面積縮減及外來(lái)入侵種的影響等，造成了某些魚(yú)類資源的衰退和瀕臨滅絕。已有92種淡水魚(yú)類被列為瀕危物種［2］。另外，養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展導(dǎo)致養(yǎng)殖魚(yú)類近親繁殖越加嚴(yán)重，不合理引種，種質(zhì)退化，遺傳多樣性銳減，個(gè)體小型化，對(duì)環(huán)境和病害的防御能力下降，病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究如何保護(hù)和利用好現(xiàn)有的水產(chǎn)種質(zhì)資源和遺傳多樣性，實(shí)現(xiàn)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展是我國(guó)未來(lái)漁業(yè)科技發(fā)展的重點(diǎn)之一。

低溫保存是通過(guò)低溫抑制細(xì)胞代謝，使細(xì)胞由常溫下的高能耗、強(qiáng)代謝狀態(tài)，進(jìn)入一種能量消耗、新陳代謝降至最低點(diǎn)的休眠狀態(tài)。生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)在溫度降低到-130℃時(shí)幾乎會(huì)完全停止。如果降溫方式合適，生物體系內(nèi)部高度有序的結(jié)構(gòu)狀態(tài)不被打亂，蛋白質(zhì)、酶以及其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)均未被破壞，復(fù)溫后就能恢復(fù)活力［3］。根據(jù)這一原理，研究者對(duì)魚(yú)類配子和胚胎低溫保存進(jìn)行了大量的探索，并已成功凍存了魚(yú)類精子，為解決魚(yú)類品種的異地異時(shí)雜交育種、珍稀魚(yú)類繁殖、物種遺傳物質(zhì)的長(zhǎng)期保存提供了可能性。在魚(yú)類卵子和胚胎玻璃化冷凍保存方面，由于魚(yú)類卵子具有體積大、雙層卵膜、透水性差、含有大量卵黃物質(zhì)等特點(diǎn)，同時(shí)由于魚(yú)類生物學(xué)基礎(chǔ)研究的缺乏和低溫冷凍技術(shù)手段的局限性，盡管許多學(xué)者在冷凍保護(hù)劑毒性、細(xì)胞滲透性、降溫方法等各方面進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的成績(jī)，但目前仍未取得突破性的進(jìn)展。本文綜述近年來(lái)幾種魚(yú)類胚胎低溫冷凍保存的成果、新技術(shù)及其研究進(jìn)展。

1 魚(yú)卵及胚胎冷凍保存

近年來(lái)，魚(yú)類卵細(xì)胞和胚胎低溫和超低溫保存的研究引起人們的高度重視。盡管許多學(xué)者對(duì)魚(yú)類胚胎的冷凍損傷機(jī)理［4］、適宜冷凍的胚胎發(fā)育階段［5］、抗凍保護(hù)劑的種類和濃度［6］、冷凍降溫方法［7］和解凍復(fù)活技術(shù)［8］等進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究，但目前尚未取得真正的突破。現(xiàn)將近年來(lái)在魚(yú)類卵細(xì)胞和胚胎冷凍保存上取得的主要結(jié)果匯總于表1。

2 魚(yú)類胚胎超低溫冷凍

2.1 應(yīng)用抗凍蛋白

一般抗凍劑對(duì)冷凍材料都有一定的毒性作用，且毒性隨抗凍劑濃度的提高而增加。因此尋求一種既能夠抑制冷凍溶液中冰晶形成，又不會(huì)對(duì)冷凍材料有毒性作用，或者毒性作用較小的新型抗凍劑非常必要。1969年，Devries 在南極Mcmurdo 海峽的一種Nototheneniid 魚(yú)血液中首先發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，抗凍蛋白是一類具有熱滯效應(yīng)、冰晶形態(tài)效應(yīng)和重結(jié)晶抑制效應(yīng)的蛋白質(zhì)。迄今為止共發(fā)現(xiàn)5種抗凍蛋白，分別為抗凍糖蛋白(AFGPs)、Ⅰ型抗凍蛋白 (AFP Ⅰ)、Ⅱ型抗凍蛋白 (AFP Ⅱ)、Ⅲ型抗凍蛋白 (AFP Ⅲ)和Ⅳ型抗凍蛋白 (AFP Ⅳ)［16］。

表1 某些魚(yú)類卵細(xì)胞及胚胎冷凍的保存成活率

Robles 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，向金頭鯛2 細(xì)胞期胚胎中顯微注射抗凍蛋白能顯著增加胚胎的低溫耐受能力。Martínez-Páramo 等［18］在冷凍斑馬魚(yú)胚胎時(shí)，在抗凍劑中添加了1 mL 的AFP I (10 mg·mL-1)，使胚胎的存活率從30% 提高到了55%。因此，將化學(xué)抗凍劑和抗凍蛋白混合使用，不僅降低了化學(xué)抗凍劑的使用濃度，減小了對(duì)胚胎的毒性，同時(shí)提高了魚(yú)類胚胎冷凍保存的存活率。

2.2 應(yīng)用水通道蛋白

由于魚(yú)卵的雙層卵膜結(jié)構(gòu)限制了水分和抗凍劑在膜兩邊的滲透，使抗凍劑難以滲透進(jìn)入卵內(nèi)，因此尋找一種改變膜通透性的方法至關(guān)重要。水通道蛋白 (aquaporin，AQPs)，最初由Agre 等于1988年偶然在紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)，稱為形成通道的整合膜蛋白 (CHIP 28)，1991年，研究人員完成其cDNA克隆并進(jìn)一步確定其為細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)水的特異性通道蛋白，并稱CHIP 28 為AQP 1。此后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了水通道蛋白家族中的13個(gè)亞型 (AQP 0– AQP 12)。根據(jù)AQPs 的滲透特異性可將AQPs 分為2類:第1 類只對(duì)水有滲透性，如AQP 0-2、AQP 4-6、AQP 8 等;第2 類除轉(zhuǎn)運(yùn)水之外，還對(duì)其他小分子溶質(zhì)有滲透性，尤其是甘油，包括AQP 3、AQP 7、AQP 9-10 等［19］。

Delgado 等［20］將AQP 3 的cRNA 注射到未成熟的青鳉卵細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)水的滲透性接近未注射的正常卵細(xì)胞的2 倍，Gly、EG、PG和DMSO 的滲透性均明顯高于未注射的正常卵細(xì)胞，分別達(dá)到了 (2.20 ±1.29)×10-3，(2.98 ±0.36)×10-3，(3.93 ±1.70)×10-3，(3.11 ±0.74)×10-3cm·min-1，且經(jīng)注射cRNA 后的未成熟卵細(xì)胞有51%發(fā)育成熟、發(fā)育成熟后有43%的卵細(xì)胞成功受精孵化。

2.3 顯微注射技術(shù)

魚(yú)類胚胎在冷凍保存過(guò)程中，內(nèi)部的卵黃囊是魚(yú)類胚胎冷敏感性的關(guān)鍵部位。卵黃囊內(nèi)含有水分，冷凍過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生冰晶對(duì)胚胎造成損傷，但由于卵黃被卵黃合胞體層所包圍，卵黃合胞體層通透性差，阻礙了抗凍劑進(jìn)入卵黃。因此有必要尋找一種方法來(lái)克服這一難點(diǎn)。

顯微注射法最初應(yīng)用于基因工程，后來(lái)Liu等［21］利用這一技術(shù)對(duì)斑馬魚(yú)的6 體節(jié)期胚胎進(jìn)行了部分卵黃 (50%～75%)去除，低溫冷凍后發(fā)現(xiàn)去除部分卵黃后，斑馬魚(yú)胚胎存活率及低溫耐受性均顯著提高。但是6 體節(jié)期胚胎在去除部分卵黃后出現(xiàn)了對(duì)部分冷凍保護(hù)劑 (如甲醇、丙二醇)的不滲透性?？梢?jiàn)去除部分卵黃對(duì)降低魚(yú)類胚胎冷凍的難度可能會(huì)具有一定的意義，但技術(shù)有待進(jìn)一步突破。

Janik 等［22］率先將此方法應(yīng)用到斑馬魚(yú)胚胎冷凍保存中，后來(lái)Beir?o 等［23］將顯微注射技術(shù)應(yīng)用在金頭鯛的低溫冷凍中，并發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可以對(duì)尾芽期胚胎使用更高濃度的冷凍保護(hù)劑，而不會(huì)對(duì)胚胎造成毒害，但是在改善胚胎冷敏感性方面并無(wú)顯著影響。武鵬飛等［24］研究了顯微注射抗凍劑種類、抗凍劑的注射劑量、注射濃度，以及抗凍劑注射后牙鲆胚胎的冷敏感性影響，發(fā)現(xiàn)抗凍劑毒性PVP ＞蔗糖，DMSO ＞MeOH ＞PG ＞PM (PG∶MeOH 體積比2 ∶1)，牙鲆胚胎較適宜的顯微注射劑量為750 pL，且顯微注射后胚胎的冷敏感性有一定的降低。

2.4 飛秒激光脈沖技術(shù)

顯微注射技術(shù)使用的納米針都是入侵式的，容易對(duì)胚胎內(nèi)結(jié)構(gòu)、相鄰細(xì)胞以及卵膜等造成破壞。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)飛秒激光技術(shù)可以有效地應(yīng)用于生物學(xué)研究中。大多數(shù)細(xì)胞在近紅外波段是透明的，因此近紅外飛秒激光對(duì)細(xì)胞的穿透深度深，且當(dāng)飛秒激光聚焦于透明材料時(shí)，聚焦處的光強(qiáng)非常高，足以引起非線性吸收，但聚焦處附近的熱影響非常小，對(duì)鄰近細(xì)胞幾乎沒(méi)有損壞。同時(shí)當(dāng)激光束在膜上聚焦幾毫秒時(shí)，產(chǎn)生了瞬態(tài)的小孔，由于細(xì)胞膜具有流動(dòng)性，損傷的細(xì)胞膜會(huì)在短時(shí)間內(nèi)得到修復(fù)，從而再次形成完整的屏障［25］。

Kohli 等［26］在對(duì)狗腎細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，利用飛秒激光脈沖技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穿孔不會(huì)造成細(xì)胞崩解、氣泡形成等細(xì)胞形態(tài)變化。同時(shí)將抗凍劑蔗糖通過(guò)瞬態(tài)小孔成功地滲透進(jìn)狗腎細(xì)胞中［27］。之后又利用飛秒激光脈沖技術(shù)成功地將異硫氰酸熒光素、DNA (Simian-CMV-EGFP)等導(dǎo)入到斑馬魚(yú)的未去膜和去膜的胚胎中［28］。

2.5 超聲波空化

超聲波空化作用是指存在于液體中的微氣核(空化泡)在聲波的作用下振動(dòng)，當(dāng)聲壓達(dá)到一定值時(shí)發(fā)生的生長(zhǎng)和崩潰的動(dòng)力學(xué)過(guò)程?？栈饔靡话惆?個(gè)階段，空化泡的形成、長(zhǎng)大和劇烈的崩潰。時(shí)蘭春等［29］指出穩(wěn)態(tài)空化作用形成的空化泡可使其周圍的酶或細(xì)胞顆粒受到微聲流作用下的切應(yīng)力作用，這可能導(dǎo)致細(xì)胞的破壞。但是低強(qiáng)度超聲波產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)空化作用對(duì)細(xì)胞的破壞很小，主要是改變細(xì)胞膜的滲透性，促進(jìn)可逆滲透，加強(qiáng)物質(zhì)運(yùn)輸，從而增加代謝活性和促進(jìn)有益物質(zhì)的生成。

Bart 等［30］認(rèn)為超聲波空化在提高胚胎甲醇滲透性上是物理?yè)p傷最小的方法。Silakes 等［31］研究了超聲波對(duì)不同發(fā)育時(shí)期、不同去膜程度 (完全去膜、卵膜軟化、未去膜)斑馬魚(yú)胚胎的甲醇滲透性影響，發(fā)現(xiàn)超聲波處理能明顯提高胚胎的甲醇滲透性，且90%外包期最高達(dá)到了 (85.3 ±8.1)μmol，但是仍遠(yuǎn)低于胚胎玻璃化所需濃度(10 mol·L-1)［32］。

3 展望

目前上述幾種新技術(shù)在魚(yú)類胚胎低溫保存中的應(yīng)用還不夠廣泛，但已經(jīng)引起了許多低溫工作者的濃厚興趣，并取得了一些研究成果。但是這些技術(shù)仍存在一些問(wèn)題，如水通道蛋白和超聲波空化雖提高了胚胎對(duì)抗凍劑的滲透性，但仍遠(yuǎn)未到達(dá)胚胎玻璃化的最佳濃度;顯微注射法容易對(duì)胚胎造成入侵式破壞;而飛秒激光技術(shù)還存在著價(jià)格高昂、儀器結(jié)構(gòu)龐大、可操作性差等問(wèn)題。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展、各學(xué)科之間的相互交叉、各種新技術(shù)的不斷研發(fā)、各類技術(shù)的不斷結(jié)合，魚(yú)類胚胎冷凍保存技術(shù)必將不斷成熟與突破，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的前景一片光明。

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