李方暉，楊海平，覃 飛

1.Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China；2.South China Normal University，Guangzhou 510006，China.

前言

肌肉衰減征（Sarcopenia）作為一種以骨骼肌質量和肌力衰減為主要特征的增齡性機能退化征，長期以來為人們所忽視［2，5］。Sarcopenia引發(fā)的骨質減少、運動平衡能力下降將增加肢體殘疾、Ⅱ型糖尿病、心血管病變、關節(jié)炎、心理疾病等發(fā)生幾率［38］。流行病學調(diào)查顯示，近13%的60歲以上老年人受Sarcopenia所困擾，該比例在80歲以上老人高達50%［50］。Sarcopenia發(fā)生機制與肌肉蛋白質合成下降和分解增加及肌細胞凋亡增加有關［4，33，43］。

體育運動是保持骨骼肌整體功能、延緩骨骼肌衰老的最有效方法［4］。文獻報道，只有較大強度的力量訓練才能增加骨骼肌蛋白合成，弱化衰老骨骼肌凋亡信號，從而阻止肌細胞大范圍地進入凋亡程序而導致Sarcopenia加劇，逆轉老年人骨骼肌質量和力量下降［4，33，53］。然而，大強度的抗阻訓練易增加老年人受傷幾率，且運動即刻心率增加、血壓升高易引發(fā)老年人心血管疾病。由于耐力運動會減損力量練習積累起來的骨骼肌質量，使得人們對耐力運動是否可用于Sarcopenia的防治仍存在爭議［14］。但鑒于耐力運動具有增強骨骼肌的線粒體功能、提升細胞抗氧化水平、抑制細胞凋亡信號等作用，近年來，國內(nèi)、外學者相繼研究了耐力運動對Sarcopenia的防治作用［4，41，47］。漆正堂等［4］通過對8月齡老年小鼠進行為期4周大強度耐力運動后發(fā)現(xiàn)，運動組小鼠股四頭肌和腓腸肌的活性氧含量及其誘導的DNA 氧化損傷顯著性降低，線粒體膜電位顯著增加。但運動強度較大會加劇DNA 氧化損傷和肌細胞凋亡［4］。Pasini等［41］研究發(fā)現(xiàn)，8周中等強度耐力運動上調(diào)16月齡老年大鼠骨骼肌線粒體細胞色素氧化酶C（cytochrome c oxidase，COX）活性的同時，老年大鼠骨骼肌蛋白質合成途徑也得到明顯強化。Song 等［47］進一步研究發(fā)現(xiàn)，8周中等強度耐力運動后16月齡老年大鼠比目魚肌的凋亡明顯減少，這跟骨骼肌抗氧化酶活性水平得到提升有關。

盡管人們通過聚合酶鏈式反應、蛋白質免疫印跡等分子生物學技術發(fā)現(xiàn)了多種與體育運動改善Sarcopenia有關的基因和蛋白，初步揭示出改善骨骼肌線粒體功能、提升細胞抗氧化活性、促進蛋白質合成可能是長期運動訓練防治Sarcopenia潛在機制。但由于基因表達調(diào)控機制的復雜性及蛋白質功能多樣性，其中任何一種方法都不能獲得對疾病發(fā)生和整體代謝過程的全面認識［4，5，41，47］。蛋白組 學技術以其高分辨率、高流通量等優(yōu)點，已被廣泛應用于對疾病相關蛋白標示物的篩查及其機制研究。尤其近年來在骨骼肌生物學領域的應用較為普遍［8，24，55］。本實驗采 用蛋白組學技術，通過雙向凝膠電泳（2－DE）串聯(lián)質譜技術，研究8周中等強度低負荷量運動（60%～75%˙VO2max，每天每次15min，5天／周）對16月齡増齡大鼠腓腸肌蛋白質組表達圖譜的影響，從系統(tǒng)生物學角度深入揭示長期訓練延緩Sarcopenia的分子機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器設備：固相pH 梯度等電聚焦千膠條（Immobilise dry strip pH3－10、長度18cm，購自Amersham 公司）、IPGphor等電聚焦電泳系統(tǒng)（購自Amershan Pharmacia公司）、聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直平板電泳槽（購自bio－rad 公司）、MDLDI－TOF MS質譜儀（購自Bruker Daltonics公司）、圖像掃描儀（購自中晶科技）。

試劑：尿 素、NP－40、載體兩性電解 質（Parmalyte 3－10）、PMSF、CHAPS、SDS、溴酚藍、丙烯酰胺、BIS均為Amersham Pharmacia公司；低分子量標準蛋白混合物（兔磷酸化酶B97400、牛血清白蛋白66700、兔肌動蛋白43000、牛碳酸配酶31000、胰蛋白酶抑制劑20300、雞蛋清溶菌酶14400）、AP購自Bio－rad公司；硫代硫 酸 鈉購自Fluka公司；Bradford試劑盒、考馬斯亮藍G－250、巰基乙醇、甘氨酸、乙腈、碳酸氫氨、鐵氰化鉀、乙醇、乙酸鈉、硝酸銀、甲醛、碳酸鈉、硫脲等均購自美國Sigma公司。

1.2 動物分組與運動方案

12只18月齡雌性Sprague－Dawley大鼠購于廣州中醫(yī)藥大學動物中心，體質量為378±11g，清潔級。在室溫20℃～24℃、光照時間7：00—19：00 條件下分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由進食和飲水。適應性喂養(yǎng)1周后，12只大鼠隨機分為對照組和運動實驗組，每組6只。負荷強度參照Bejma等［18］實驗中増齡大鼠訓練負荷進行。運動組進行8周中等強度低負荷量運動（速度15 m／min，跑臺坡度5°，每組15min，5 天／周），負荷強度相當于60%～70%˙VO2max［18］。

1.3 取材與樣品制備

運動訓練方案結束后6h，運動組和對照組同時麻醉，對大鼠體重和腓腸肌組織進行稱重。計算腓腸肌指數(shù)＝腓腸肌重量（mg）／體重（g）。隨后取腓腸肌80 mg，用液氮碾成粉末狀，按1∶4 比例加入裂液，組內(nèi)合并上清。用Bradford法對樣品蛋白定量。蛋白濃度按每管1mg分裝。4 ℃振搖30min，組織懸液12 000r／min，4 ℃離心30min，吸取上清－70 ℃冰箱保存待用。

1.4 雙向凝膠電泳（2－DE）與圖像、質譜分析

參考張松江等［8］方法進行蛋白質固相－pH 梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳（2－DE），掃膠后進行圖像分析，隨后酶解并進行質譜分析。

1.5 數(shù)據(jù)庫查詢

依據(jù)NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫，將質譜所測肽質量指紋譜數(shù)據(jù)峰的列表通過Matrix Science網(wǎng)站提供的搜索引擎Mascot進行查詢。查詢參數(shù)：物種來源鼠；胰蛋白質酶水解；酶解片段不完全選擇為1；肽片段相對分子質量最大允許誤差控制在±0.1Da等。

1.6 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，F(xiàn)IN 采用獨立樣本t檢驗。用Image Master 2DPlatinum V 5.0分析軟件檢驗差異蛋白點相對含量的差別是否有統(tǒng)計學意義。差異性檢驗顯著性水平設定為P＜0.05。

2 結果

2.1 運動大鼠腓腸肌指數(shù)的改變

表1顯示，8周中等強度低負荷量運動后，與對照組相比，運動組腓腸肌重量增加了30.0%（P＜0.05），腓腸肌指數(shù)增加37.5%（P＜0.01），但體重沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表1 本研究體重、腓腸肌重量及腓腸肌指數(shù)一覽表Table 1 Weight，Gastrocnemius Weight（GW）and Gastrocnemius Weight Index（GWI）（n＝6）

2.2 雙向凝膠電泳圖譜分析結果

將電泳所得的凝膠掃描，以對照組右腓腸肌蛋白質2－DE 代表圖譜作為參考膠進行PDques軟件分析。結果表明，運動組和對照組的蛋白質斑點數(shù)目分別是（1 943.5±23）和（1 821±35）個，匹配率分別為77.15%±3.87%和76.67%±3.91%，相關系數(shù)分別為0.856 和0.909。表明本次實驗獲得了較好的重復性，已達到軟件分析的要求。

圖1為對照組和運動組大鼠右腓腸肌總蛋白在pH3－10固相膠條上等電聚焦后再經(jīng)SDS－PAGE 分離，并通過硝酸銀染色得到的代表圖譜。

圖1 本研究對照組（左）和運動組（右）大鼠右腓腸肌蛋白質2－DE圖譜Figure 1.The 2－DE Maps of Right Gastrocnemius Proteins from the Control Group（left）and the Exercise Group（right）

2.3 腓腸肌蛋白質組差異表達的定量分析結果

由圖2可見，蛋白質分子量多集中在10～130kDa；蛋白質等電點（pI）多集中在4.0～7.0，極酸性和極堿性的蛋白很少。經(jīng)PDquest軟件分析，8周中等強度低負荷量運動后，運動組有19 個蛋白質點的表達發(fā)生1 倍以上變化（表2），并在圖2中綠色標出，其中，變化倍數(shù)在2 倍以上有6個；上調(diào)和下調(diào)的2 倍以上的蛋白質點分別有3 個，未見新增與缺失的蛋白質點（圖2，表2）。

圖2 本研究運動8周后表達量差異點的位置示意圖Figure 2.The Histograms of Protein Spots Changed after 8－week Exercise

2.4 圖譜分析和鑒定

表3顯示了對表達量變化2 倍以上6 個蛋白斑點用質譜進行鑒定，并于NCBI數(shù)據(jù)庫檢索獲得的肽譜和肽段氨基酸的結果。A02 號點鑒定出為熱應激同源蛋白70，等電點為5.41，相對分子量為69.961kDa；運動后下調(diào)2.29倍；A07號點定為26S蛋白水解酶的調(diào)節(jié)亞基6B，等電點為5.17，相對分子量44.548kDa，運動后下調(diào)2.36倍；A15號點為肌動蛋白結合蛋白，等電點為5.81，相對分子量16.884kDa，運動后下調(diào)2.06倍；B01號點為線粒體乙醛脫氫酶2，等電點為5.88，相對分子量130.361 kDa，運動后上調(diào)2.67倍；B02號點為α－酮戊二酸脫氫酶復合體，等電點為6.30，相對分子量106.451kDa，運動后上調(diào)2.51倍；B03號點為細胞膜修復相關蛋白，等電點為6.26，相對分子量53.402kDa，運動后上調(diào)2.54倍。

3 討論

文獻報道［4，41，47］，不同強度、不同方式的體育運動均能增加増齡大鼠不同肌纖維類型的骨骼肌質量，包括比目魚肌、股四頭肌、腓腸肌等。本研究表1 顯示，8周中等強度低負荷量運動（60%～75%˙VO2max）后腓腸肌重量也增加30.0%，腓腸肌指數(shù)增加37.5%。提示，該運動方案能防止Sarcopenia的肌肉質量下降。因此，本研究在此運動模型的基礎上選取腓腸肌進一步研究骨骼肌蛋白質組圖譜的變化。2－DE 聯(lián)合質譜技術能靈敏的反映不同生理或病理刺激下的骨骼肌蛋白 質組 變 化［8，24，55］。近年來，人們應用2－DE聯(lián)合質譜技術研究了不同強度長期訓練誘導骨骼肌適應性應答機制［24］、一次性離心運動導致肌纖維微損傷及其運動性疲勞的分子機制［55］、體育運動改善Ⅱ型糖尿病患者骨骼肌胰島素敏感性的分子機制［1］。為深入揭示骨骼肌生物學調(diào)控機制提供新的思路［8，24，55］。本研究應用蛋白質組學方法首次分析了中等強度低負荷量運動對增齡大鼠腓腸肌蛋白質組差異表達，并對差異2 倍以上的6種蛋白進行質譜鑒定，鑒定出了熱應激同源蛋白70、26S 蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基6B、肌動蛋白結合蛋白Cofilin、線粒體乙醛脫氫酶2、α－酮戊二酸脫氫酶復合體、細胞膜修復相關蛋白TRIM72，分別參與細胞凋亡、蛋白質水解、線粒體功能、肌細胞膜修復等功能調(diào)控。同時，結合已有文獻報道，本研究將對這6種蛋白是否由長期訓練引起適應性改變進行分析，進而有利于揭示體育運動延緩骨骼肌衰老的分子機制。

表2 本研究運動后差異表達大于1倍的蛋白質點一覽表Table 2 The Protein Spots Whose Expression Different＞1Folds after Training

表3 本研究運動后部分差異表達蛋白點質譜鑒定結果一覽表Table 3 Identification of Differential Expressed Protein Spots by MS／MS after Exercise

3.1 熱休克同源蛋白70

熱休克同源蛋白70（heat shock cognate 70kDa protein，HSC70）也稱為組成型熱休克蛋白70（HSP70），與誘導型熱休克蛋白70（HSP70）共同組成HSP70 家族，兩者氨基酸序列近85%相似。盡管在結構上相似，但氨基酸序列的氨基末端差異使兩者呈現(xiàn)功能特異性。HSC70 在大多數(shù)細胞都有較高的含量。非折疊蛋白產(chǎn)生后，HSC70 迅速遷移核中，與非折疊核糖體前體和變性蛋白質特異性的結合，參與維持其底物蛋白正常的空間構象。然而，對于無法進行修復的錯誤折疊蛋白，HSC70 和HSP70 形成二聚體后再與其結合，從而有利于26S蛋白酶體的識別并對錯誤折疊蛋白進行特異性水解［34］。因此，HSC70 對于胞內(nèi)蛋白質“質量控制”及蛋白質內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持起重要作用。

文獻也報道［16，21，46］，HSC70可調(diào)控細胞程序性死亡過程。細胞實驗發(fā)現(xiàn)［46］，體外高濃度葡萄糖培養(yǎng)或培養(yǎng)過程中添加蛋白激酶抑制劑處理誘導的神經(jīng)元細胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)HSC70 蛋白表達顯著性增加。動物實驗表明，肌萎縮側索硬化癥誘導的神經(jīng)元細胞凋亡過程中HSC70 蛋白表達也明顯上調(diào)［21］。Boyd－Kimball等［16］用2－DE 聯(lián)合質譜研究了神經(jīng)退行性疾病患者的不同腦區(qū)的蛋白差異表達，結果表明，神經(jīng)退行性疾病相關的神經(jīng)元細胞凋亡與HSC70表達增加有關。Burté等［17］研究發(fā)現(xiàn)，HSC70 表 達增加與線粒體功能失調(diào)所引發(fā)的氧化應激及錯誤折疊蛋白積累有關。Matsui等［35］在紅細胞實驗中進一步發(fā)現(xiàn)了HSC70可維持促凋亡因子Bim（bcl－2interacting mediator of cell death，Bim）信使核糖核酸（message RNA，mRNA）的結構穩(wěn)定性。值得指出的是，Bim 在骨骼肌細胞凋亡過程中起重要作用［3］。

Chen等［19］研究了18個月的自愿鍛煉和耐力運動對5月齡大鼠海馬神經(jīng)元的蛋白質組影響，結果表明，長期耐力運動的大鼠認知功能得到改善的同時，海馬神經(jīng)元的HSC70蛋白表達顯著降低。盡管Chen 等［19］沒有觀察海馬神經(jīng)元細胞凋亡，但Chen等［19］實驗中安靜組大鼠是23月齡。Chen G 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，18月齡SD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率明顯增加，后者誘發(fā)認知功能障礙。提示，長期體育運動可預防老齡大鼠的認知功能障礙與抑制海馬神經(jīng)元凋亡有關，而后者與HSC70 蛋白表達降低相關。由于Chen等［19］實驗模型中的大鼠經(jīng)歷了18 個月長期跑臺運動，說明HSC70 蛋白表達降低是長期訓練帶來的適應性改變。本研究表3 顯示，8周中等強度低負荷量運動大鼠腓腸肌的HSC70蛋白表達減少。結果說明，8周中等強度低負荷量運動引起的骨骼肌HSC70 蛋白表達減少同樣是長期訓練所引起的適應性改變。由此推測，長期中等強度低負荷量運動通過誘導HSC70 表達減少來弱化HSC70／Bim 軸活性，進而抑制Sarcopenia 肌細胞凋亡；此外，作為適應性應激因子，HSC70 表達適應性下調(diào)可能與細胞氧化應激及錯誤折疊蛋白相關的內(nèi)質網(wǎng)應激程度減輕有關。從下文鑒定的α－酮戊二酸脫氫酶、線粒體醛脫氫2、26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基6B間接證實這一假設。

3.2 26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基6B分子

26S蛋白酶體由圓桶狀的20S 蛋白酶體和多種調(diào)節(jié)復合物組成。調(diào)節(jié)復合物中最常見的有19S調(diào)節(jié)復合體。ATP 存在情況下，19S調(diào)節(jié)復合物與20S蛋白酶體組裝成有活性的26S蛋白酶體。19S調(diào)節(jié)復合體至少有20 多個亞基組成，其中包含兩個亞結構，分別是“蓋子”和“基底”。26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基6B 分子（26Sprotease regulatory subunit 6B，S6B）是19S調(diào)節(jié)復合體的基底部成員之一，具有ATP 水解酶活性。在識別并結合泛素化的底物之后，S6B水解ATP 打開折疊結構、改變構象和去除泛素，主動轉運展開的蛋白到20S蛋白酶體，使底物蛋白質進入20S降解復合體，進行靶蛋白特異性酶解［10］。

蛋白質合成減少、分解增加導致蛋白質大量丟失是Sarcopenia重要機制［43］。Bardag－Gorce等［15］研究發(fā)現(xiàn)，18～32月齡大鼠19S 調(diào)節(jié)復合體的mRNA 表達持續(xù)性增加，但介導蛋白質水解過程的泛素mRNA 沒有增加。提示，26S蛋白酶體在Sarcopenia蛋白質過度水解過程中起更重要的作用。Altun等［11］研究證實，與4月齡青年大鼠相比，30月齡大鼠骨骼肌26S蛋白酶體表達增加3 倍。盡管單次損傷性的離心運動可使26S蛋白酶體途徑活性增加［51］，但重復性耐力和力量訓練具有抑制泛素蛋白酶體活性的作用［10，27］。說明骨骼肌26S 蛋白酶體的活性變化與運動強度和運動方式相關。Willoughby 等［52］讓脊髓損傷患者做12周被動腿部自行車康復訓練，結果顯示，肌球蛋白重鏈mRNA 含量顯著增加，26S 蛋白酶體mRNA 水平卻下降。Kee等［27］對大鼠進行連續(xù)5 天遞增負荷運動，并于24h后取材，結果表明，骨骼肌26S 蛋白酶體蛋白表達減少。結合Willoughby等［52］和Kee等［27］不難看出，運動訓練下調(diào)骨骼肌26S 蛋白酶體蛋白表達是適應性過程。本研究表3顯示，8周中等強度低負荷量運動后，大鼠腓腸肌S6B蛋白表達也呈現(xiàn)適應性地減少。提示，長期中等強度低負荷量運動能抑制衰老骨骼肌26S蛋白酶體活性水平，有利于減少蛋白質過度水解。結合Pasini等［41］研究發(fā)現(xiàn)的體育運動上調(diào)16月齡老年大鼠骨骼肌蛋白質合成途徑可推測，中等強度低負荷量運動從抑制蛋白質分解和促進蛋白質合成兩個途徑共同拮抗Sarcopenia的骨骼肌蛋白質丟失。

3.3 肌動蛋白結合蛋白

作為一種低分子量（21kD）的肌動蛋白結合蛋白，Cofilin基本功能是結合并解聚F肌動蛋白（F－actin），通過影響F－actin骨架重組調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多種信號轉導通路。哺乳動物的cofilin基因分別編碼Cofilin1 和Cofilin2 兩種亞型，在肌肉發(fā)育以及胚胎期到出生早期都有表達。在肌原纖維形成早期促進肌動蛋白絲重組。研究發(fā)現(xiàn)［13］，cofilin基因缺失將導致新生小鼠肌節(jié)Z線在第7 天起出現(xiàn)明顯斷裂。另，cofilin表達減少導致F－actin無法解聚，引發(fā)骨骼肌肌病［41］。

文獻報道［49］，cofilin蛋白從胞漿中轉運進入肌細胞線粒體中將誘導細胞色素C 釋放，后者導致促凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3（caspase－3）及其線粒體依賴的凋亡途徑活化，引發(fā)肌細胞凋亡。Donoghue等［23］比較青年和老齡大鼠腓腸肌的蛋白差異表達，結果發(fā)現(xiàn)，骨骼肌衰老過程中骨骼肌的Cofilin蛋白表達顯著增加。提示，Cofilin可能介導Sarcopenia的骨骼肌凋亡過程。Vainshtein等［49］研究發(fā)現(xiàn)，10周自愿轉輪運動抑制Cofilin進入線粒體，從而降低c－jun氨基末端激酶的磷酸化水平及其下游線粒體相關的凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）表達、Bax／bcl－2 比值；同時上調(diào)線粒體COX 活性，最終抑制氧化應激誘導的肌細胞凋亡。Vainshtein等［49］研究說明，抑制老齡大鼠骨骼肌Cofilin蛋白表達、阻止Cofilin轉運進入線粒體是長期運動訓練誘導骨骼肌適應性應答的過程。本研究表3 結果顯示，8周中等強度低負荷量運動后老齡大鼠腓腸肌Cofilin蛋白表達顯著性減少。結合前文發(fā)現(xiàn)的HSC70，說明長期中等強度低負荷量運動通過共同調(diào)節(jié)Cofilin 和HSC70適應性表達來保護Sarcopenia肌細胞凋亡；另，從下文看出，中等強度低負荷量運動還通過上調(diào)線粒體代謝酶的適應性表達來促進肌細胞存活，如α－酮戊二酸脫氫酶和線粒體醛脫氫2表達。這也得到Vainshtein等［49］研究的證實。Vainshtein等［49］研究揭示了線粒體COX 活性在10周耐力運動后明顯適應性上調(diào)。

3.4 線粒體乙醛脫氫酶2

線粒體乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是NAD（P）＋依賴的醛脫氫酶超家族的成員之一，具有脫氫酶和脫酯酶催化活性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的人體中共表達19種線粒體乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDHs）亞型，常見的有ALDH1－ALDH4 4種。其中的ALDH2位于線粒體，而ALDH1、ALDH3、ALDH4 則位于胞漿［36］。Stewart等［45］通過Northern雜交技術分析人體不同組織器官的ALDHs分布，結果顯示，ALDH2 在心肌、骨骼肌、脾臟以及肝臟表達豐度最高。ALDH2 結構為四聚體蛋白，每個亞基前體由517 個氨基酸殘基組成，成熟亞基由500個氨基酸組成。ALDH2可分解乙醛及其衍生物4－氫壬烯醛（4－HNE），減輕醛類對細胞的氧化損傷。ALDH2活性降低可使乙醛向乙酸鹽的分解過程受阻，使體內(nèi)乙醇代謝中間產(chǎn)物乙醛濃度增高，導致細胞內(nèi)乙醛積聚，由于醛類物質具有很強的氧化性和細胞毒性，故引起ALDH2失活的因素均可導致醛類物質堆積，對機體組織造成不可逆的損傷。研究發(fā)現(xiàn)［39］，除了將進入體內(nèi)乙醇氧化為無毒性的乙酸之外，ALDH2 還具有抗氧化和抗凋亡的效應。

ALDH2在心肌、皮膚、神經(jīng)、肝臟、晶狀體等組織的功能基本清楚，但在骨骼肌中鮮見報道。機體衰老過程常伴有ALDH2活性降低或表達下降［40］。通過轉基因技術、給予ALDH2興奮劑及長期訓練等手段來增加ALDH2 活性水平能拮抗衰老導致的心肌細胞和海馬神經(jīng)元凋亡，延緩衰老［9，12］。Alvarez－López等［12］采用基因芯片技術分析了6周自由輪轉運動對快速老化小鼠海馬神經(jīng)元基因組差異表達的影響，結果顯示，ALDH2表達上調(diào)可能介導長期訓練延緩快速老化小鼠海馬的衰老過程。Alvarez－López等［12］進一步說明，6周自由輪轉運動刺激海馬神經(jīng)元ALDH2基因表達是適應性過程。本研究表3 證實，8周中等強度低負荷量運動刺激老年大鼠骨骼肌ALDH2蛋白同樣也可能是骨骼肌適應性應答過程。然而，ALDH2 是否具有抗骨骼肌凋亡的作用有待深入研究揭示。

3.5 α－酮戊二酸脫氫酶復合體

α－酮戊二酸脫氫酶復合體（α－ketoglutarate dehydrogenase complex，α－KGDH）主要由3個酶（α－酮戊二酸脫氫酶、琥珀酰基轉移酶、二氫硫辛酸脫氫酶）和5 個輔助因子（焦磷酸硫胺素、硫辛酸、輔酶A、輔酶Ⅰ、黃素腺嘌呤二核苷酸）共同組成。α－KGDH 是三羧酸循環(huán)的限速酶，主要通過催化α－酮戊二酸氧化脫羧后生成琥珀酰輔酶A。衰老相關的氧化應激能導致機體的α－KGDH 活性和基因表達下調(diào)，進而引發(fā)神經(jīng)、骨骼肌及心肌線粒體功能失調(diào)和細胞凋亡。Hansford等［25］研究發(fā)現(xiàn)，與青年大鼠（6月齡）相比，老齡大鼠（24月齡）的比目魚α－KGDH 活性顯著降低。人體實驗進一步表明，老年人（61～74歲）有氧耐力下降與骨骼 肌α－KGDH活性降低有關［28］。Kim 等［29］應用蛋白質組學手段研究缺血／再灌注大鼠心肌損傷的差異蛋白表達，結果表明，α－KGDH 蛋白表達降低與缺血誘導心肌細胞凋亡有關。Yan等［54］分析了年輕與老齡猴子的左心室肌蛋白差異表達，結果同樣發(fā)現(xiàn)，衰老引發(fā)的心肌病變與左心室肌α－KGDH 蛋白表達減少有關。然而，補充肉堿可上調(diào)老齡大鼠骨骼肌α－KGDH 活性，后者有利于增強線粒體電子傳遞鏈耦合，進而改善老齡大鼠骨骼肌能量狀態(tài)［31］。

表3顯示，8周中等強度低負荷量運動老齡大鼠腓腸肌α－KGDH蛋白表達增加2.5倍。Tikkanen等［48］的人體實驗證實，以家庭為基礎的12月運動訓練能增加中老年男性的骨骼肌α－KGDH 活性。動物實驗發(fā)現(xiàn)［30］，長期低強度運動可增加Duchenne型肌營養(yǎng)不良模型小鼠（mdx小鼠）骨骼肌α－KGDH 活性，后者可降低mdx小鼠骨骼肌的氧化應激損傷。說明，α－KGDH 表達改變是長期訓練導致骨骼肌適應性應答的結果。結合3.4 推測，α－KGDH 與ALDH2表達的適應性改變可能在長期訓練改善増齡大鼠骨骼肌線粒體功能、抑制肌細胞凋亡的過程中起協(xié)同作用。但有待進一步研究證實。

3.6 細胞膜修復相關蛋白

細胞膜修復相關蛋白（tripartite motif－containing protein 72，TRIM72）是TRIM 家族蛋白之一，也稱為MG53（mitsugumin 53）。Trim 72 主要表達在骨骼肌和心肌中，介導肌肉細胞膜損傷的正常修復及骨骼肌胰島素抵抗、心肌缺血／再灌注損傷等病理過程［7］。作為骨骼肌胰島素信號的負性調(diào)控因子，TRIM72 通過與E3 泛素連接酶結合來調(diào)節(jié)胰島素受體和IRS1泛素依賴的降解過程［44］。細胞膜損傷修復過程中，TRIM72 直接轉位到膜損傷的部位，與磷脂酰絲氨酸和另一種參與細胞膜自身修復有關的跨膜蛋白Dysferlin特異性結合，從而加速膜修復過程［37］。Jung等［26］研究發(fā)現(xiàn)，TRIM72啟動子區(qū)的E－box元件上具有促進成肌調(diào)節(jié)因子（MyoD）和肌增強因子2（MEF2）基因轉錄的保守位點。提示，TRIM72 可通過增加MyoD 和MEF2基因轉錄來促進成肌細胞分化，加速肌肉損傷后的再生過程。然而，TRIM72 基因缺陷會導致小鼠的運動能力降低、膜修復功能缺陷，并引發(fā)骨骼肌萎縮［32］。Cao等［22］對心肌研究發(fā)現(xiàn)，缺血／再灌注會導致心肌TRIM72 表達下調(diào)；缺血預適應或TRIM72過表達能抑制氧化應激誘導心肌細胞凋亡，但缺血預適應對敲除TRIM72 基因的心肌細胞保護作用則完全消失。推測，TRIM72 在促進骨骼肌膜損傷位點修復的同時，也可能抑制肌細胞凋亡。

尹苗苗等［6］研究發(fā)現(xiàn)，6周大強度耐力運動可使14周齡小鼠股四頭肌的TRIM72 表達增加2.1 倍。尹苗苗等［6］進一步表明，骨骼肌TRIM72 表達增加是長期訓練引起的適應性過程。本研究表3 同樣顯示，8周中等強度低負荷量運動后，大鼠腓腸肌TRIM72 表達增加2.5 倍。說明體育運動可通過誘導TRIM72 適應性表達來加速骨骼肌損傷的修復過程［6］，進而維持肌細胞膜的完整性。然而，TRIM72是否介導體育運動保護Sarcopenia骨骼肌凋亡有待進一步研究。圖3 總結了體育運動可能通過調(diào)控以下3個途徑保護Sarcopenia。

圖3 8周中等強度低負荷量運動保護sarcopenia的可能機制示意圖Figure 3.A Hypothesis for Explaining how 8 Weeks Low－loads of Medium Intensity Exercise Protecting Sarcopenia

4 結論

1.8 周中等強度低負荷量運動后增齡大鼠腓腸肌蛋白質組發(fā)生了顯著性地變化。

2.成功篩選鑒定出6種目標差異蛋白，其表達量發(fā)生適應性變化提示，8周中等強度低負荷量運動可能通過同時調(diào)控以下3個途徑保護Sarcopenia：1）通過調(diào)控衰老骨骼肌線粒體代謝相關酶、肌動蛋白結合蛋白、熱休克同源蛋白70以及細胞膜修復相關蛋白表達來抑制骨骼肌細胞凋亡過程；2）通過下調(diào)26S 蛋白水解酶表達抑制蛋白質分解，進而拮抗Sarcopenia骨骼肌蛋白質丟失；3）促進細胞膜修復相關蛋白表達改善Sarcopenia的肌細胞膜修復功能。

［1］褚曉蕾，牛燕媚，袁海瑞，等.有氧運動對胰島素抵抗小鼠骨骼肌抗氧化相關蛋白的影響［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2011，30（9）：825－830.

［2］李海鵬，王立豐，關尚一，等.Sarcopenia關聯(lián)的線粒體介導的細胞凋亡信號通路的增齡性變化及爬梯運動對其的影響［J］.體育科學，2010，30（7）：56－61.

［3］李方暉，劉承宜，楊海平，等.高糖誘導成肌細胞應激的低強度單色光調(diào)節(jié)的實驗研究［J］.體育科學，2012，32（8）：40－48.

［4］漆正堂，賀杰，張媛，等.65%～75%最大強度的耐力運動對老齡小鼠骨骼肌線粒體氧化應激與膜電位的影響［J］.體育科學，2010，30（10）：46－51.

［5］溫煦，王梅，張一民，等.中國城鎮(zhèn)居民骨骼肌含量和骨骼肌力量在增齡過程中的變化研究［J］.體育科學，2010，30（3）：36－41.

［6］尹苗苗，牛燕媚，袁海瑞，等.有氧運動對胰島素抵抗小鼠骨骼肌脂代謝相關蛋白的影響［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2011，30（7）：618－624.

［7］伊木清，Ma Jianjie.MG53－肌細胞損傷的“分子繃帶”［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2012，31（12）：80－84.

［8］張松江，史紹蓉.急性大強度力竭運動大鼠骨骼肌比較蛋白質組學研究［J］.體育科學，2006，26（5）：59－63.

［9］張鵬.乙醛脫氫酶2抑制氧化應激導致的心肌細胞凋亡及其分子機制［D］.上海：復旦大學博士學位論文，2010.

［10］朱榮，馬延超，許壽生，等.一次大強度運動后大鼠骨骼肌收縮蛋白降解和26S 蛋白酶體活性的變化［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2011，29（3）：305－308.

［11］ALTUN M，BESCHE H C，OVERKLEEFT H S，etal.Muscle wasting in aged，sarcopenic rats is associated with enhanced activity of the ubiquitin proteasome pathway［J］.J Biol Chem，2010，285（51）：39597－39608.

［12］ALVAREZ－LóPEZ M J，CASTRO－FREIRE M，COSN－TOMS M，etal.Long－termexercisemodulates hippocampal gene expression in senescent female mice［J］.J Alzheimers Dis，2013，33（4）：1177－1190.

［13］AGRAWAL P B，JOSHI M，SAVIC T，etal.Normal myofibrillar development followed by progressive sarcomeric disruption with actin accumulations in a mouse Cfl2 knockout demonstrates requirement of cofilin－2for muscle maintenance［J］.Hum Mol Genet，2012，21（10）：2341－2356.

［14］BAAR K.Training for endurance and strength：lessons from cell signaling［J］.Med Sci Sports Exe，2006，38（11）：1939－1944.

［15］BARDAG－GORCE F，F(xiàn)AROUT L，VEYRAT－DUREBEX C，et al.Changes in 20Sproteasome activity during ageing of the LOU rat［J］.Mol Biol Rep，1999，26（1－2）：89－93.

［16］BOYD－KIMBALL D，POON HF，LYNN B C，etal.Proteomic identification of proteins specifically oxidized in Caenorhabditis elegans expressing human Abeta（1－42）：implications for Alzheimer＇s disease［J］.Neurobiol Aging，2006，27（9）：1239－1249.

［17］BURT F，DE GIROLAMO L A，HARGREAVES A J，etal.Alterations in the mitochondrial proteome of neuroblastoma cells in response to complex 1inhibition［J］.J Proteome Res，2011，10（4）：1974－1986.

［18］BEJMA J，JI L L.Aging and acute exercise enhance free radical generation in rat skeletal muscle［J］.J Appl Physiol，1999，87：465－470.

［19］CHEN W Q，DIAO W F，VIIDIK A，etal.Modulation of the hippocampal protein machinery in voluntary and treadmill exercising rats［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1784（3）：555－562.

［20］CHEN G，GONG M，YAN M，etal.Sevoflurane induces endoplasmic reticulum stress mediated apoptosis in hippocampal neurons of aging rats［J］.PLoS One，2013，8（2）：e57870.

［21］CASONI F，BASSO M，MASSIGNAN T，etal.Protein nitration in a mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis：possible multifunctional role in the pathogenesis［J］.J Biol Chem，2005，280（16）：16295－16304.

［22］CAO C M，ZHANG Y，WEISLEDER N，etal.MG53constitutes a primary determinant of cardiac ischemic preconditioning［J］.Circulation，2010，121（23）：2565－2574.

［23］DONOGHUE P，STAUNTON L，MULLEN E，etal.DIGE analysis of rat skeletal muscle proteins using nonionic detergent phase extraction of young adult versus aged gastrocnemius tissue［J］.J Proteomics，2010，73（8）：1441－1453.

［24］GELFI C，DE PALMA S.2D－DIGE analysis of protein extracts from muscle tissue［J］.Methods Mol Biol，2012，854：155－168.

［25］HANSFORD R G，CASTRO F.Age－linked changes in the activity of enzymes of the tricarboxylate cycle and lipid oxidation，and of carnitine content，in muscles of the rat［J］.Mech Ageing Dev，1982，19（2）：191－200.

［26］JUNG S Y，KO Y G.TRIM72，a novel negative feedback regulator of myogenesis，is transcriptionally activated by the synergism of MyoD（or myogenin）and MEF2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，396（2）：238－245.

［27］KEE A J，TAYLOR A J，CARLSSON A R，etal.IGF－I has no effect on postexercise suppression of the ubiquitin－proteasome system in rat skeletal muscle［J］.J Appl Physiol，2002，92（6）：2277－2284.

［28］KACZOR J J，ZIOLKOWSKI W，ANTOSIEWICZ J，etal.The effect of aging on anaerobic and aerobic enzyme activities in human skeletal muscle［J］.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2006，61（4）：339－344.

［29］KIM N，LEE Y，KIM H，etal.Potential biomarkers for ischemic heart damage identified in mitochondrial proteins by comparativeproteomics［J］.Proteomics，2006，6（4）：1237－1249.

［30］KACZOR J J，HALL J E，PAYNE E，etal.Low intensity training decreases markers of oxidative stress in skeletal muscle of mdx mice［J］.Free Radic Biol Med，2007，43（1）：145－154.

［31］LUCAS D T，SZWEDA L I.Declines in mitochondrial respiration during cardiac reperfusion：age－dependent inactivation of alpha－ketoglutarate dehydrogenase［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96（12）：6689－6693.

［32］LEE C S，YI J S，JUNG S Y，etal.TRIM72negatively regulates myogenesis via targeting insulin receptor substrate－1［J］.Cell Death Differ，2010，17（8）：1254－1265.

［33］MARZETTIE，LEES H A，MANINI T M，etal.Skeletal muscle apoptotic signaling predicts thigh muscle volume and gait speed in community－dwelling older persons：an exploratory study［J］.PLoS One，2012，7（2）：e32829.

［34］MISHRA A，GODAVARTHI S K，MAHESHWARI M，etal.The ubiquitin ligase E6－AP is induced and recruited to aggresomes in response to proteasome inhibition and may be involved in the ubiquitination of Hsp70－bound misfolded proteins［J］.J Biol Chem，2009，284（16）：10537－10545.

［35］MATSUI H，ASOU H，INABA T.Cytokines direct the regulation of Bim mRNA stability by heat－shock cognate protein 70［J］.Mol Cell，2007，25（1）：99－112.

［36］MOON KH，KIM B J，SONG B J.Inhibition of mitochondrial aldehyde dehydrogenase by nitric oxide－mediated S－nitrosylation［J］.FEBS Lett，2005，579（27）：6115－6120.

［37］MATSUDA C，MIYAKE K，KAMEYAMA K，etal.The C2A domain in dysferlin is important for association with MG53（TRIM72）.PLoS Curr，2012，4：e5035add8caff4.

［38］ORTEGA F B，SILVENTOINEN K，TYNELIUS P，etal.Muscular strength in male adolescents and premature death：cohort study of one million participants［J］.BMJ，2012，345：e7279.

［39］OHSAWA I，KAMINO K，NAGASAKA K，etal.Genetic deficiency of a mitochondrial aldehyde dehydrogenase increases serum lipid peroxides in community－dwelling females［J］.J Hum Genet，2003，48（8）：404－409.

［40］OHTA S，OHSAWA I.Dysfunction of mitochondria and oxidative stress in the pathogenesis of Alzheimer＇s disease：on defects in the cytochrome c oxidase complex and aldehyde detoxification［J］.J Alzheimers Dis，2006，9（2）：155－166.

［41］PASINI E，LE DOUAIRON LAHAYE S，F(xiàn)LATI V，etal.Effects of treadmill exercise and training frequency on anabolic signaling pathways in the skeletal muscle of aged rats［J］.Exp Gerontol，2012，47（1）：23－8.

［42］PAPALOUKA V，ARVANITIS DA，VAFIADAKI E，etal.Muscle LIM protein interacts with cofilin 2and regulates F－actin dynamics in cardiac and skeletal muscle［J］.Mol Cell Biol，2009，29（22）：6046－6058.

［43］RENNIE M J，SELBY A，ATHERTON P，etal.Facts，noise and wishful thinking：muscle protein turnover in aging and human disuse atrophy［J］.Scand J Med Sci Sports，2010，20（1）：5－9.

［44］SONG R，PENG W，ZHANG Y，etal.Central role of E3ubiquitin ligase MG53in insulin resistance and metabolic disorders［J］.Nature，2013，494（7437）：375－379.

［45］STEWART M J，MALEK K，CRABB D W.Distribution of messenger RNAs for aldehyde dehydrogenase 1，aldehyde dehydrogenase 2，and aldehyde dehydrogenase 5in human tissues［J］.J Investig Med，1996，44（2）：42－46.

［46］SHORT D M，HERON I D，BIRSE－ARCHBOLD J L，etal.Apoptosis induced by staurosporine alters chaperone and endo－plasmic reticulum proteins：Identification by quantitative proteomics［J］.Proteomics，2007，7（17）：3085－3096.

［47］SONG W，KWAK H B，LAWLER J M.Exercise training attenuates age－induced changes in apoptotic signaling in rat skeletal muscle［J］.Antioxid Redox Signal，2006，8：517－528.

［48］TIKKANEN H O，HMLINEN E，HRKNEN M.Significance of skeletal muscle properties on fitness，long－term physical training and serum lipids［J］.Atherosclerosis，1999，142（2）：367－378.

［49］VAINSHTEIN A，KAZAK L，HOOD D A.Effects of endurance training on apoptotic susceptibility in striated muscle［J］.J Appl Physiol，2011，110（6）：1638－1645.

［50］VON HAEHLING S，MORLEY J E，ANKER S D.From muscle wasting to sarcopenia and myopenia：update2012［J］.J Cachexia Sarcopenia Muscle，2012，3（4）：213－217.

［51］WILLOUGHBY D S，TAYLOR M，TAYLOR L.Glucocorticoid receptor and ubiquitin expression after repeated eccentric exercise［J］.Med Sci Sports Exe，2003，35（12）：2023－2031.

［52］WILLOUGHBY D S，PRIEST J W，JENNINGS R A.Myosin heavy chain isoform and ubiquitin protease mRNA expression after passive leg cycling in persons with spinal cord injury［J］.Arch Phys Med Rehabil，2000，81（2）：157－163.

［53］YARASHESKI KE，PAK－LODUCA J，HASTEN D L，etal.Resistance exercise training increases mixed muscle protein synthesis rate in frail women and men＞／＝76yr old［J］.Am J Physiol，1999，277（Pt 1）：E118－125.

［54］YAN L，GE H，LI H，etal.Gender－specificproteomicalterations in glycolytic and mitochondrial pathways in aging monkey hearts［J］.J Mol Cell Cardiol，2004，37（5）：921－929.

［55］ZHAO L，YAN W，XIANG H，etal.Proteomic investigation of changes in rat skeletalmuscleafter exercise－induced fatigue［J］.Biol Res，2012，45（1）：75－80.