衣 慧 王俊超 司靜文 張玉芬 王宗仁 李軍昌△

（1.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院，陜西 西安 710032；2.山東省壽光市中醫(yī)院，山東 壽光 262700）

缺血性心臟病嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率和死亡率近年來逐漸上升，其病理特點是心肌血管的狹窄或堵塞，導致心肌梗死。在中醫(yī)學中缺血性心臟病屬“胸痹”、“心痛”范疇，氣虛血瘀，脈絡不暢是其病機關鍵［1-2］。急性心梗發(fā)生后的再灌注療法可恢復缺血組織的血供，有效地挽救缺血組織，但是，再灌注療法受缺血組織血管再通時間的限制并存在再灌注損傷等問題［3］。本實驗通過對心梗SD 大鼠模型應用芪丹通脈片（QDTMT）來觀察心梗大鼠氣虛血瘀表征、缺血心肌血管新生及缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）mRNA 及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）mRNA的表達，并探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 動物 SD 大鼠80 只，雄性，體質(zhì)量（230±20）g，該實驗經(jīng)第四軍醫(yī)大學倫理委員會批準，實驗動物許可證號：No.0022401。

1.2 藥物及儀器 QDTMT 提取浸膏干粉（藥物組成為黃芪30 g，當歸15 g，丹參30 g，紅花30 g，桂枝10 g。1 g 干粉相當于2.86 g 生藥）由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院中醫(yī)科提供。小鼠抗大鼠CD31抗體（美國Abcam 公司）；小鼠抗大鼠免疫組化試劑盒（北京正四柏生物科技有限公司）；Trizol（Gibco 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix（日本TaKaRa 公司）；小動物呼吸機（BW-BM1103-200 型，上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；光學顯微鏡（尼康）；體式顯微鏡（Olymps）；超薄切片機（LEICA CM 1900）；RT-PCR 儀（BIO-RAD）。

1.3 造模與分組 雄性SD 大鼠腹腔注射30 g/L 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，經(jīng)口氣管插管，連接小動物呼吸機。于左側(cè)胸骨旁3、4 肋間打開胸腔，暴露心臟，以7-0 絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，待左室前壁變蒼白時，說明MI 模型已建立成功。然后逐層關胸并排出胸腔氣體。另設假手術（Sham）組18 只，只在相同部位穿線并不結(jié)扎，余步驟相同。待大鼠自主呼吸后撤去呼吸機。術后24 h 大鼠存活72 只，除Sham 組的18 只外，隨機分為梗死組（MI 組）、MI+芪丹通脈片小劑量（MI+QDTMTL）組和MI+芪丹通脈片大劑量（MI+QDTMTH）組 各18 只，其 中MI+QDTMTL 組 給 予QDTMT 浸膏干粉0.36 g/kg，MI+QDTMTH 組3.24 g/kg，Sham 組和MI 組給予生理鹽水3 mL/kg，QDTMT 浸膏干粉溶于生理鹽水中各組等體積灌胃，每日灌胃1次。

1.4 動態(tài)觀察（1）一般情況。4 周后觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、五官爪甲顏色及尾部特征等。（2）舌下脈絡。實驗第4 周時分別對各組大鼠進行30 g/L 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，用兩根細線分別將大鼠的上下牙拉開后，用濕棉簽輕觸舌面，舌體伸出，并翻轉(zhuǎn)顯露舌下脈絡，在自然光線下觀察其舌色及舌底脈絡。針對氣虛血瘀證出現(xiàn)的青紫舌，主要從舌色和舌底靜脈長度的兩個方面擬定了量化評分標準。評分標準如下：正常舌—底色微青、舌靜脈主干長度不超過舌體3/4，記為0 分；輕度紫暗—舌底色紫暗或舌靜脈主干長度超過舌體3/4，記為1 分；明顯紫暗—舌底色紫暗且舌靜脈主干長度超過舌體3/4，記為2 分。

1.5 標本采集與檢測 4 周后，稱取大鼠體質(zhì)量，腹腔注射30 g/L 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，打開大鼠胸腔，充分暴露心臟，剪開右心耳用PBS 及40 g/L 多聚甲醛灌注，待心臟變白后取出心臟，每只大鼠沿結(jié)扎線向下取0.3 cm 厚心臟橫斷面組織1 塊，40 g/L 多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制作5 μm的石蠟切片。另，部分大鼠于第7日、14日及28日時心臟取材，打開胸腔后PBS 灌注，取下部分非梗死心肌組織放入預冷的Trizol 中，用于提取心肌總RNA。（1）檢測心梗邊緣區(qū)CD31的表達。采用小鼠抗大鼠免疫組化試劑盒進行免疫組化染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟、入水、抗原修復；切片浸入3%H2O2中浸泡10 min，PBS 洗2 min×3次；加試劑A 封閉10 min，PBS 洗2 min×3次；加入1∶100 小鼠抗大鼠CD31 單克隆抗體，置于濕盒中4℃過夜。PBS 洗后加試劑B 孵育10 min，PBS 洗2 min×3次，再加試劑C 孵育10 min，PBS 洗2 min×3次；DAB顯色；自來水充分沖洗后，復染，鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片、鏡檢。（2）測定各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管數(shù)、微血管密度。心肌組織經(jīng)CD31免疫組化染色后的切片，采用Weidner 法計數(shù)MVD［4］，經(jīng)圖像分析儀分析系統(tǒng)分析處理，先在40×的光鏡視野下找到心梗邊緣區(qū)血管密度最高的5個區(qū)域，然后在400×視野下計數(shù)血管高密度區(qū)血管數(shù)目，凡是染成棕黃色單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇均作為一個血管計數(shù)，管腔內(nèi)徑大于20 μm 或有較厚肌層（3 層以上）的則不予計數(shù)。每張切片隨機選5個視野，計數(shù)MVC，取其平均值即平均微血管數(shù)目作為本例大鼠的MVC 值；用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)測定其陽性染色面積比（MVD），具體計算方法為MVD=MVC2/mm2。（3）心梗后7 d、14 d 和28 d，各組大鼠隨即抽取6 只常規(guī)心臟取材，提取總RNA，用RT-PCR 方法檢測各組大鼠HIF-1α 及VEGF mRNA的表達情況，①RNA 提?。喊凑誘rizol的說明書提取心肌總RNA，并溶于50 μg DEPC 水處理水中。②RT 反應：取2 μg 總RNA，按照Super ScriptTMⅡRNase H-Reverse Transcriptase（Invitrogen 公司）的說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。③PCR 反應：反應體系為20 μg。擴增HIF-1α 基因的引物序列：Forward：5'-CAGCAGACCCAGTTACAGAA-3'，Reverse：5'-TC AGTFAACTFGATCCAAAGCTCT-3'；VEGF 基因的引物序列：Forward：5'-TGCACCCACGACAGAAGGG-3'：Reverse：5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3'；擴增內(nèi)參β-actin 基因的引物序列：Forward：5'-AGGTGACAGCATYGCTTCTG-3'；Reverse：5'-GCTGCCTCAA CACTCAAC-3'，引物均由北京賽百盛生物工程公司合成。按照TaKaLa 實時定量試劑盒加樣，通過PCR 儀器進行檢測，PCR的反應條件為：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用GraphPad Prism5.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間均值兩兩比較采用SNK 或Dunnett T3檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠氣虛血瘀表征的變化

2.1.1 各組一般情況比較 見表1。

表1 各組一般情況比較

2.1.2 舌下脈絡 Sham 組大鼠舌色淡紅，舌下脈絡清晰紅潤，舌象綜合評分為0 分（93.33%）；MI 組大鼠舌色紫暗，舌下脈絡擴張，青紫粗長，舌象綜合評分以2分為主（80.00%）；MI+QDTMTL 組大鼠舌色暗紅，舌下脈絡較Sham 組增粗增長，舌象綜合評分以1 分為主（66.67%）；MI+QDTMTH 組大鼠舌色紅潤，舌下脈絡較Sham 組略增粗增長，舌象綜合評分以1 分為主（86.67%）。

2.2 CD31單克隆抗體免疫組化染色結(jié)果 見圖1。MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組CD31的表達較MI組增強，且MI+QDTMTH 組高于MI+QDTMTL 組。

2.3 各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管數(shù)、微血管密度的比較 見表2。Sham 組、MI 組、MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組均可看到新生的微血管，但Sham 組微血管增生不明顯，MI 組可看到少量的微血管增生，MI+QDTMTL 組可看到較多量的微血管增設，而MI+QDTMTH 組可見到大量的微血管增生。

圖1 CD31單克隆抗體免疫組化染色結(jié)果（×200）

表2 各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管數(shù)及微血管密度比較（±s）

表2 各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管數(shù)及微血管密度比較（±s）

與Sham 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與MI 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與MI+QDTMTL 組比較，▲P＜0.05。

2.4 芪丹通脈片對各組大鼠HIF-1α mRNA 及VEGF mRNA 表達的影響 見圖2。結(jié)果如下：（1）7 d時，與Sham 組相比，其余各組HIF-1α mRNA 急劇升高（P＜0.01），以MI+QDTMTH 組表現(xiàn)最為明顯；各組VEGF mRNA的表達也有所升高（P＜0.05）；（2）14 d時，除Sham 組外，各組HIF-1α mRNA的表達繼續(xù)增高，與MI 組相比，MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組HIF-1α的表達有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），且以MI+QDTMTH組增高更為顯著；除Sham 組外，各組VEGF mRNA的表達有所降低，MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組同MI 相比仍然具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；（3）28 d時，MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組HIF-1α mRNA的水平明顯降低，與MI 組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05 或0.01），VEGF mRNA的表達也有所降低，與MI 組相比具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

3 討論

近年來，中醫(yī)藥在治療性血管再生中的作用倍受關注［5］，益氣活血法在缺血心肌治療性血管再生中有著重要的指導意義。芪丹通脈片是在中醫(yī)氣血理論指導下，通過臨床辨證而研制的復方中成藥，已獲得國家新藥證書（國藥證字Z20090035）和國家新藥批準文號（國藥準字Z20090252），既往實驗證明其具有改善心肌缺血程度及減少心肌缺血范圍的作用，并對急性心肌缺血危險因素高血脂、高血黏、冠心病、心絞痛有較好的治療作用［6-7］，本實驗結(jié)果表明，芪丹通脈片能夠改善心梗大鼠氣虛血瘀癥狀，促進梗死邊緣區(qū)的血管新生，一定時間內(nèi)能夠上調(diào)HIF-1α 與VEGF mRNA的表達，且高劑量組比低劑量組療效更加明顯。

圖2 大鼠心肌梗死后心肌組織中HIF-1αmRNA 及VEGF mRNA 水平的變化

HIF-1α 是在缺氧/缺血條件下，哺乳動物組織細胞產(chǎn)生的一種由HIF-1α 亞基和HIF-1β 亞基組成的核轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α 是HIF-1的活性亞基和氧調(diào)節(jié)亞基［8］，在非低氧細胞中幾乎不表達，在缺氧條件下表達明顯增加，而HIF-1β 幾乎在所有細胞中廣泛表達且不受氧張力的影響［9-10］。VEGF 是HIF-1α的下游靶基因，是內(nèi)皮細胞特異性的促有絲分裂原，主要生物學功能是促進內(nèi)皮細胞增殖、新生血管形成和增加血管通透性。HIF-1α 作為引發(fā)各種缺氧應激蛋白表達的轉(zhuǎn)錄因子，在缺血的適應性反應中起核心作用，它可以通過促進下游相關基因如VEGF 等的轉(zhuǎn)錄和表達，從而使機體對缺血、缺氧產(chǎn)生代償性適應反應［11］。HIF-1α被認為是缺血環(huán)境血管新生的“發(fā)動機”［12-13］。在缺血心肌中穩(wěn)定表達的HIF-1α 信號不僅能促細胞存活和血管新生，而且促進側(cè)支循環(huán)的形成，且新生血管具有正常血管相似的結(jié)構(gòu)，無血管滲漏現(xiàn)象［14］。局部注射穩(wěn)定表達HIF-1α的腺病毒表達質(zhì)粒后，可形成具有周圍細胞包繞的出牙毛細血管。VEGF 是HIF-1α 介導的血管新生的關鍵下游因子［15］。然而，單獨應用VEGF 刺激所形成的新生血管表現(xiàn)出形態(tài)不完整、存在滲漏現(xiàn)象［16］，這些研究表明HIF-1α 是缺血心肌治療性血管新生與穩(wěn)定的關鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。本實驗研究結(jié)果表明大鼠心梗后1 周、2 周，心肌中HIF-1α 及VEGF表達升高，且芪丹通脈片治療組要高于MI 組，4 周后，HIF-1α 及VEGF 表達相應下調(diào)，芪丹通脈片治療組要低于MI 組，大劑量組低于小劑量組，筆者推測可能是芪丹通脈片能夠促進能夠活化HIF-1α 信號分子，上調(diào)HIF-1α 及VEGF的表達從而促進非梗死區(qū)血管新生，且呈劑量依賴性，隨著新生血管生成后，心肌缺血缺氧得到改善，HIF-1α 及下游VEGF的表達又相應下調(diào)。

綜上所述，HIF-1α 在缺血性心臟病治療性血管新生與成熟過程中發(fā)揮著關鍵性作用，益氣活血復方芪丹通脈片能夠上調(diào)HIF-1α 下游的VEGF 來介導血管新生，通過活化HIF-1α 信號來影響新生血管的成熟與穩(wěn)定，然而目前對HIF-1α 調(diào)控血管成熟的機制尚不明確，后期筆者將對這一現(xiàn)象展開研究。

［1］吳煥林，阮新民，楊小波.319例冠心病患者證候分布規(guī)律分析［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（6）：498-501.

［2］何慶勇，王階，張允嶺，等.女性冠心病中醫(yī)證候?qū)W及冠脈病變特點研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，29（10）：879-882.

［3］楊來寶，溫苑，馬國超，等.中藥早期干預對急性心肌梗死患者心功能的影響［J］.山西中醫(yī)，2012，28（3）：11-13.

［4］Losodo DW，Isner JMl.Gene therap y f o rmyocardial angiogenesis［J］.Am Hreat J，1999，138：132.

［5］陳文元，吳立婭，陳 巖，等.中藥影響血管新生作用機制研究進展［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2009，15（3）：237-239.

［6］王宗仁，鄭瑾，馬愛玲，等.中藥芪丹通脈片對動脈粥樣硬化大鼠主動脈內(nèi)皮細胞及PAI-1 表達影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2004，25（14）：1290-1293.

［7］李晶華，王宗仁，肖鐵卉，等.芪丹通脈片預防異丙腎上腺素所致的大鼠慢性心肌缺血［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2003，24（5）：397-399.

［8］Jiang BH，Zheng JZ，Leung SW，et al.Transactivation and inhibitory domains of hypoxia-inducible factor 1 alpha.Modulation of transcriptional activity by oxygen tension［J］.J Biol Chem，1997，272（31）：19253-19260.

［9］Zhao HX，Wang XL，Wang YH，et al.Attenuation of myocardial injury by postconditioning：role of hypoxia inducible factor-1α［J］.Basic Res Cardiol，2010，105（1）：109-118.

［10］Xie JJ，Liao YL，Yang L，et al.Ultrasound molecular imaging of angiogensis induced by mutant fbrms of hypoxia induced factor-1α［J］.Cardiovasc Res，2011，92（2）：256-266.

［11］Kido M，Du L，Sullivan CC，et al.Hypoxia-inducible factor 1alpha reduces infarction and attenuates progession of cardiac dysfunction after myocardial infarction in the mouse［J］.J Am Coll Cradiol，2005，46（11）：2116-2124.

［12］Pugh CW，Ratcliffe PJ.Regulation of angiogenesis by hypoxia：role of the HIF system［J］.Nat Med，2003，9（6）：677-684.

［13］Shohet RV，Garcia JA.Keeping the engine primed：HIF actors as key regulators of cardiac metabolism and angiogenesis during ischemia［J］.J Mol Med，2007，85（12）：1309-1315.

［14］Dou GR，Wang YC，Hu XB，et al.RBP-J，the transcription factor downstream of Notch receptors，is essential for the maintenance of vascular homeostasis in adult micel［J］.FASEB J，2008，22（5）：1606-1617.

［15］Dong H，Wang Q，Zhang Y，et al.Angiogenesis induced by hVEGF165 gene controlled by hypoxic response elements in rabbit ischemia myocardium［J］.Exp Biol Med（Maywood），2009，234（12）：1417-1424.

［16］Elson DA，Thurston G，Huang LE，et al.Induction of hypervascularity without leakage or inflammation in transgenic mice over expressing hypoxia-inducible factor-1α［J］.Genes Dev，2001，15：2520-2532.