鄭 平 陳鐵龍 祝光禮 赫小龍

（1.浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院，浙江 杭州 310000）

心肌梗死后冠狀動脈閉塞血流中斷，部分心肌因嚴(yán)重而持久的缺血，導(dǎo)致了心肌細(xì)胞的不可逆的損傷、凋亡，是影響心肌梗死預(yù)后的主要原因。提高心肌的抗凋亡能力是目前防治心肌梗死的熱點(diǎn)之一。冠心合劑可改善心肌血供，對缺血心肌有保護(hù)作用［1-2］。此研究通過觀察冠心合劑對大鼠急性心肌梗死后心功能、凋亡及缺血邊緣區(qū)凋亡蛋白Fas、FasL 蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，探討其對缺血心肌保護(hù)的可能機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 動物 雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 藥物與試劑 冠心合劑（組成：黃芪30 g，蒲黃20 g，五靈脂20 g），濃縮成2 g/mL的生藥煎劑，由杭州市中醫(yī)院制劑室提供。β-actin、Fas，caspase-8 和caspase-3 鼠單克隆抗體，F(xiàn)asL 兔多克隆抗體，購自美國Santa Cruze 生物技術(shù)公司。一抗稀釋液、HRP 標(biāo)記二抗，購自杭州達(dá)文生物有限公司。蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA 法），購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。TUNEL 試劑盒，購自美國羅氏公司。

1.3 模型制備 80 只SD 大鼠隨機(jī)分為5 組：冠心合劑大、中、小劑量組、對照組、模型組各16 只。冠心合劑各組于手術(shù)前7 d 開始灌胃，劑量分別為每日28 g/kg、14 g/kg、7 g/kg，對照組于相同時間給予滅菌蒸餾水2 mL/d 灌胃。大鼠麻醉后，連接實(shí)驗(yàn)動物呼吸機(jī)行正壓呼吸。用6-0 號無創(chuàng)帶針縫合線穿過左冠狀動脈前降支，進(jìn)針深度約為1～2 mm，結(jié)扎左冠狀動脈前降支，造成急性心肌梗死模型，心電圖出現(xiàn)ST 段明顯弓背抬高提示造模成功。對照組不結(jié)扎冠狀動脈。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 血流動力學(xué)檢測 術(shù)后4 h 行血流動力學(xué)檢測。麻醉后，分離右側(cè)頸總動脈，三通管連接20 G 靜脈鞘管和壓力換能器，將壓力傳感器與Medlab-U/4CS 生物信號采集處理系統(tǒng)相連，測量并記錄每只大鼠的左室內(nèi)壓峰值（LVSP）、左室等容收縮末期壓力上升最大速度（+dp/dtmax），左室舒張末壓力（LVEDP）、左室壓力下降最大速度（-dp/dtmax）等參數(shù)。

1.4.2 原位末端標(biāo)記（TUNEL）法各組取8 只大鼠，結(jié)扎部位以下左室心肌組織放入4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，按ROCHE 公司TUNEL 檢測試劑盒說明書操作。每個石蠟塊取6個切片，每張切片隨機(jī)選取6個視野攝片，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，圖像用Image Pro Plus 6.0 軟件分析。凋亡細(xì)胞定量計(jì)數(shù)單位以凋亡指數(shù)表示，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總觀察細(xì)胞數(shù)×100 %。

1.4.3 Western Blot 法 取大鼠左室梗死邊緣區(qū)心肌組織標(biāo)本液氮研碎，加入裂解液，經(jīng)勻漿離心后，取上清液用BCA 法測定蛋白濃度，變性后-80℃保存。取各組樣品50 μg，進(jìn)行12% SDS-PAGE 并電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1.5 h 后，加入一抗稀釋液稀釋的Fas，F(xiàn)asL 抗體，孵育過夜，加入二抗（HRP 標(biāo)記二抗，1∶1000 稀釋），ECL 發(fā)光液顯色，膠片掃描后用Image J 軟件進(jìn)行圖像分析，以β-actin（1∶1000 稀釋）作為內(nèi)參照對比，比值結(jié)果表示其蛋白的相對含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，在正態(tài)分布且方差齊的情況下對其行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 對照組大鼠活動度好，反應(yīng)靈敏，皮毛整齊、有光澤，飲食量正常。模型組大鼠動物活動度較差，反應(yīng)遲鈍，皮毛不整，無光澤，飲食量較少。冠心合劑各組大鼠活動度、反應(yīng)靈敏度、皮毛光澤和飲食量較模型組均有不同程度改善，大劑量組大鼠接近對照組。

2.2 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較 見表1。與模型組相比，冠心合劑大、中劑量組明顯改善LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax（P＜0.05）。與對照組比較，冠心合劑大劑量組在LVSP 變化上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。冠心合劑大、中劑量組在LVEDP 上無明顯變化（P＞0.05），說明冠心合劑大 劑量 組改善LVSP 及LVEDP的程度接近對照組。冠心合劑各劑量組之間兩兩比較，大劑量組在改善+dp/dtmax和-dp/dtmax方面與小劑量組相比更加明顯（P＜0.05），且存在LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax隨冠心合劑劑量的提高而升高的趨勢，LVEDP 隨冠心合劑劑量的提高而降低的趨勢，其中大劑 量 組的LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax改 善 最好，說明冠心合劑對心梗后大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)改善呈劑量依賴性，其中冠心合劑大劑量對血流動力學(xué)各指標(biāo)改善程度較高。

2.3 冠心合劑對心梗大鼠凋亡的影響 見圖1，表2。經(jīng)原位末端標(biāo)記標(biāo)記后，對照組切片中檢測到陰性細(xì)胞核染色呈藍(lán)色，模型組切片中陽性細(xì)胞核染色呈棕褐色，細(xì)胞核體積縮小，或明顯皺縮，形態(tài)多呈圓形。模型組切片心肌組織中可見大量陽性細(xì)胞核，凋亡指數(shù)明顯增加，達(dá)（58.9±12.1）%，較對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），冠心合劑組切片中陽性細(xì)胞核較少。冠心合劑大中小劑量組凋亡指數(shù)分別為（25.2±4.3）%，（32.9±6.5）%，（40.1±8.0）%，冠心合劑各劑量組凋亡指數(shù)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；冠心合劑大劑量組降低凋亡指數(shù)的作用最為明顯。

圖1 各組大鼠缺血邊緣區(qū)心肌組織TUNEL 染色（×200）

2.4 冠心合劑對心梗大鼠Fas 及FasL 蛋白表達(dá)的影響 見圖2，表2。與對照組比，模型組Fas、FasL 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。冠心合劑各劑量組Fas、FasL蛋白表達(dá)明顯降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中冠心合劑大劑量組Fas、FasL 蛋白表達(dá)下降幅度最為明顯。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較（mmHg，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

圖2 冠心合劑對心梗大鼠Fas、FasL 蛋白表達(dá)的影響

表2 兩組大鼠心梗面積、凋亡指數(shù)結(jié)果（%，±s）

表2 兩組大鼠心梗面積、凋亡指數(shù)結(jié)果（%，±s）

表3 冠心合劑對心梗大鼠Fas 及FasL 蛋白表達(dá)的影響（±s）

表3 冠心合劑對心梗大鼠Fas 及FasL 蛋白表達(dá)的影響（±s）

3 討論

急性心肌梗死后，心肌細(xì)胞凋亡或壞死，導(dǎo)致心肌部分區(qū)域活力心肌細(xì)胞減少或缺失，是心肌梗死臨床各種表現(xiàn)的臨床基礎(chǔ)。心臟自身再生和修復(fù)能力均較弱的器官，對許多刺激都較敏感，尤其是缺血。目前認(rèn)為心肌細(xì)胞是不可再生的，心肌梗死后心功能狀態(tài)與心肌細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)。如何保護(hù)心肌，減少心肌細(xì)胞凋亡，對提高心功能，改善心肌梗死預(yù)后有非常重要的意義。Kajstura 等［3］研究結(jié)果認(rèn)為凋亡是急性心肌梗死早期心肌細(xì)胞丟失的主要原因，大鼠冠狀動脈阻塞后2 h 即可在梗死區(qū)檢測到凋亡的心肌細(xì)胞，5 h 后凋亡細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰，隨后逐漸減少。壞死心肌細(xì)胞數(shù)量則明顯少于凋亡細(xì)胞，心肌細(xì)胞凋亡占梗死區(qū)所有細(xì)胞丟失的86%。TUNEL 染色［4］是一種快速和便捷的定量檢測凋亡的手段，是目前公認(rèn)的檢測組織細(xì)胞凋亡的敏感方法，用于石蠟包埋的組織，實(shí)用性較好，可靠性高。筆者前期研究提示冠心合劑可能具有缺血心肌保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，冠心合劑大、中劑量組明 顯改善LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax，同時正常情況下心肌細(xì)胞凋亡非常少，心梗后缺血心肌的凋亡明顯增加，冠心合劑各劑量組的心肌細(xì)胞凋亡均不同程度下降，其中冠心合劑大劑量組的凋亡指數(shù)最低，對心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用最明顯。

心肌細(xì)胞凋亡由兩條途徑介導(dǎo)完成，一條是內(nèi)源性途徑，一條是外源性途徑，或者同時由兩條一起來完成。內(nèi)源性途徑又稱為線粒體途徑，外源性途徑可以被FASL，腫瘤壞死因子-α 等觸發(fā)［5］。Fas，又稱CD95 是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，是由325個氨基酸組成的受體分子，F(xiàn)as 一旦和配體FasL 結(jié)合，可通過Fas 分子啟動致死性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起細(xì)胞一系列特征性變化，使細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果提示，正常心肌Fas、FasL 蛋白表達(dá)水平較低，心梗后表達(dá)上升明顯，冠心合劑各劑量組不同程度降低了Fas、FasL 蛋白的表達(dá)，其中冠心合劑大劑量組的Fas、FasL 蛋白表達(dá)水平最低［6］。

綜上所述，冠心合劑可以提高心肌梗死后大鼠心功能指標(biāo)，抑制梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡、保護(hù)缺血心肌的作用，其機(jī)制與調(diào)節(jié)Fas/FasL 系統(tǒng)、降低Fas、FasL 蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。然而，F(xiàn)as/FasL 系統(tǒng)只是凋亡發(fā)生的一條信號傳導(dǎo)途徑，冠心合劑抑制凋亡的機(jī)制是否與其他信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

［1］祝光禮，陳鐵龍，陳啟蘭.黃芪失笑湯為主治療氣虛血瘀型冠心病［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，16（10）：625-626.

［2］祝光禮，周凡，陳鐵龍.黃芪失笑散抗心肌缺血的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，26（11）：2232-2234.

［3］Kajstura J，Cheng W，Reiss K，et al.Apoptotic and necrotic myocyte cell deat hs are independent cont ributing variables of infarct size in rat s［J］.Lab Invest，1996，74（1）：86-107.

［4］張開，石玉秀.TUNEL 法-細(xì)胞凋亡的組織化學(xué)鑒定法［J］.日本醫(yī)學(xué)介紹，1994，16（10）：469.

［5］Saraste A，Viopiopulkki LM，Parvinen M，et al.Apoptosis in the heart［J］.N Engl J Med，1997，336（16）：1025-1026.

［6］Whelan RS，Kaplinskiy V，Kitsis RN.Cell death in the pathogenesis of heart disease：mechanisms and significance［J］.Annu Rev Physiol，2010，72：19-44.