沈 耀，李 娟，田月洋，呂建新

（溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院與生命科學(xué)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，浙江 溫州 325035）

谷氨酸是哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對缺血性腦損傷至關(guān)重要［1］。隨著多靶點神經(jīng)保護策略的提出，以及星形膠質(zhì)細胞在谷氨酸信號傳遞過程中的多樣化作用的被發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞已成為腦缺血神經(jīng)保護研究的焦點［2－3］。由于缺少細胞外谷氨酸代謝途徑，突觸釋放的谷氨酸必須通過星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體（gl utamate transporter，GLT），包括 GLT－1和谷氨酸－天冬氨酸轉(zhuǎn)運體（gl uta mate－aspartate transporter，GLAST）從突觸間隙轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)代謝清除［4－5］。因此，調(diào)節(jié)GLT－1／GLAST的表達和（或）活性可能是預(yù)防或治療缺血性腦損傷等疾病的潛在策略。然而，除了β－內(nèi)酰胺類抗生素外［6］，目前尚未見報道其他藥物具有調(diào)節(jié)GLT－1／GLAST表達和（或）活性的作用。因此，尋找并研究具有調(diào)節(jié)GLT－1和（或）GLAST表達及功能的藥物具有重大意義。

肌肽是一種自然存在的水溶性二肽化合物［7］，廣泛分布于動物和人類的大腦；外源性肌肽可通過血腦屏障上的肌肽轉(zhuǎn)運體進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)［8］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠局灶性腦缺血模型上，肌肽能通過降低谷氨酸的興奮性毒性損傷而發(fā)揮神經(jīng)保護作用［9］。因此，本研究采用原代培養(yǎng)的皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞為細胞模型，并采用高濃度谷氨酸攻擊損傷模型模擬腦缺血過程中產(chǎn)生的高濃度谷氨酸，研究肌肽對星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的谷氨酸信號的調(diào)節(jié)作用，為缺血性腦損傷等疾病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑

肌肽，谷氨酸，噻唑藍（MTT），D－多聚賴氨酸、Hoechst33342，碘化丙啶（pr opidiu m iodide，PI）均購自美國Sigma公司。青霉素、鏈霉素、L－谷氨酰胺、胰酶、高糖DMEM、胎牛血清均購自美國Gibco公司。o－苯二醛（o－pht haladehyde，OPA）、巰基乙醇購自美國Pickering公司。兔抗大鼠膠質(zhì)原纖維酸性蛋白抗體、豚鼠抗GLT－1多克隆抗體、豚鼠抗GLAST多克隆抗體、羅丹明標(biāo)記的抗豚鼠Ig GF（ab′）2二抗購自美國 Millipore公司。

1.2 原代星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)和鑒定

參照文獻［10］的方法，無菌條件下取出24 h齡新生SD大鼠全腦，分離左右半腦，剔除嗅球、紋狀體、海馬和基底腦組織，將皮質(zhì)組織移入另一只含有冰冷解剖液的培養(yǎng)皿中，小心剔除軟腦膜和血管。用手術(shù)刀片將皮質(zhì)組織搗碎，并用37℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶消化20 min。然后加入適量培養(yǎng)液，吹打成細胞懸液，接種到經(jīng)0.1%多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol·L－1、青霉素100 k U·L－1、鏈霉素100 mg·L－1的高糖DMEM，并在24 h后更換新培養(yǎng)液，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)10～11 d細胞鋪滿瓶底后，以240 r·min－1的速度振搖過夜。采用星形膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)志物GFAP免疫染色鑒定星形膠質(zhì)細胞純度，GFAP陽性率＞95%可以用于后續(xù)實驗。

1.3 MTT法檢測細胞存活率

星形膠質(zhì)細胞胰酶消化后以2.5×104c m－2接種于96孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后用終濃度為10 mmol·L－1谷氨酸分別培養(yǎng)24，48和72 h，以未用谷氨酸處理的星形膠質(zhì)細胞作為正常對照組。藥物處理完畢后，加入10μl MTT （5 g·L－1溶于PBS），37℃，5%CO2孵箱中繼續(xù)孵育2 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入100μl DMSO，待結(jié)晶完全溶解后在酶標(biāo)儀上測定波長570 nm處吸光度值（A570nm），細胞存活率（%）＝處理組A570nm／對照組A570nm×100%。

1.4 Hoechst33342和PI核熒光雙染法檢測細胞凋亡和壞死

星形膠質(zhì)細胞以2.5×104c m－2接種于6孔板細胞玻片上，細胞貼壁后用終濃度為10 mmol·L－1谷氨酸分別處理24，48和72 h后，以未用谷氨酸處理的星形膠質(zhì)細胞為正常對照組。作用完畢后，加入Hoechst33342溶液并使其終濃度為10 mg·L－1，37℃下孵育10 min；而后再加入PI染液，使其終濃度為10 mg·L－1，4℃下孵育10 min。用PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定。熒光顯微鏡下每張玻片隨機選取5個及以上獨立視野進行觀察拍照，并進行凋亡、壞死細胞及總細胞計數(shù)，每張玻片細胞計數(shù)不少于2000個。細胞凋亡率（%）＝凋亡細胞數(shù)／細胞總數(shù)×100%。

1.5 細胞免疫組織化學(xué)染色檢測GLT－1和GLAST的表達

星形膠質(zhì)細胞以2.5×104c m－2接種于細胞玻片上，待其貼壁。按照處理細胞分為正常對照組、谷氨酸10 mmol·L－1組、肌肽5 mmol·L－1（先給30 min）＋谷氨酸10 mmol·L－1組，藥物作用24 h。處理完畢后，取出種植有星形膠質(zhì)細胞的玻片，用PBS 0.01 mol·L－1漂洗，4℃下4%甲醛固定，空氣干燥。用PBS清洗后加入5%BSA室溫封閉2 h；加入抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白單克隆抗體（1∶400）或，豚鼠抗GLAST多克隆抗體（1∶2000）、豚鼠抗 GLT－1多克隆抗體（1∶2000），4℃反應(yīng)過夜。用PBS清洗后加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗兔Ig G（1∶100）或加入TRITC（羅丹明）標(biāo)記的F（ab′）2片段（1∶200），室溫反應(yīng)2 h。陰性對照操作完全平行，僅用5%BSA代替一抗。反應(yīng)結(jié)束后PBS清洗，用含抗熒光衰減封片劑進行封片，熒光顯微鏡下每張玻片隨機選取5個及以上獨立視野進行觀察拍照，采用Image J軟件測定熒光強度（fluorescent intensity，F(xiàn)I），表示 GLT－1和GLAST蛋白的相對表達。

1.6 實時定量PCR檢測GLT－1和GLAST mRNA的表達量

按照處理細胞分為正常對照組、谷氨酸10 mmol·L－1組、肌肽5 mmol·L－1（先給30 min）＋谷氨酸10 mmol·L－1組，藥物作用24 h；同時設(shè)肌肽5 mmol·L－1處理星形膠質(zhì)細胞1，2，3，4，5 d。細胞樣本加入Trizol后冰上勻漿，參照總RNA提取試劑盒說明方法提取總RNA。隨后測定A260／280及總RNA濃度，并校正各樣本總RNA濃度為200 g·L－1。行常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄方法后進行實時定量PCR。反應(yīng)體系為：去 RNA 酶水6.0μl，SYBR Green 10μl，上下游引物各0.8μl，模板2.0μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃20 s，變性95℃15 s，退火65℃45 s，共 40 個 循 環(huán)。GLT－1 上 游 引 物：GGAGCCAAAGCACCGAAACC和下游引物：GAAGCAGCCCGCCACATACT；GLAST上游引物：GGGTCTGTGAATGGGGTCAAT和下游引物：AAGAAGAGGATGCCCAGAGGT；β肌動蛋白上游引物：GGCTGATTCCCCTCCATCG和下游引物：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT。參考文獻［11］用2－ΔΔCt計算 GLT－1和 GLAST mRNA的相對表達水平。

1.7 高效液相色譜法檢測谷氨酸含量

參照文獻使用高效液相色譜法檢測細胞上清液谷氨酸濃度以分析星形膠質(zhì)細胞各轉(zhuǎn)運體對谷氨酸的轉(zhuǎn)運能力［12－13］。p H 7.2的平衡鹽溶液孵育細胞20 min后，按照處理細胞分為谷氨酸1 mmol·L－1組和肌肽 5 mmol·L－1（先給30 min）＋ 谷氨酸1 mmol·L－1組，作用30 min后收集細胞上清，高氯酸0.4 mol·L－1脫蛋白，0.22μm 的聚二氟乙烯膜過濾。

采用電化學(xué)高效液相色譜儀系統(tǒng)（ESA，美國）檢測樣本谷氨酸含量。色譜柱為反相C18柱（3μm，3 mm×50 mm Capcell Pak MG C18柱，Shiseido，Tokyo，日本）。OPA柱前衍生化。采用二元梯度洗脫，流動相 A，Na2HPO4100 mmol·L－1，13%乙腈和 22% 甲醇，p H 6.8；流動 相 B，Na2HPO4100 mmol·L－1，5.6%乙腈和9.4%甲醇，p H 6.8。梯度變化為：0～3.5 min，恒定100%B；3.5～20 min，線性減少到0%B；20～22 min，恒定0%B；22～23 min，線性增加到100%B；23～30 min，恒定100%B。流速0.75 ml·min－1，柱溫38℃。電勢＋250 mV和＋550 mV。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細胞的鑒定

如圖1所示，熒光顯微鏡下見綠色細胞即為GFAP免疫反應(yīng)陽性的星形膠質(zhì)細胞，占細胞總數(shù)的95%以上。

Fig.1 Glial fibrillary acidic protein（GFAP）positive cells in primarily cultured cortical astrocytes.The astr ocytes were prepared from newborn SD rats.The cells stained green were GFAP positive astrocytic cells.

2.2 谷氨酸對星形膠質(zhì)細胞存活的影響

MTT結(jié)果（圖2）顯示，與正常對照組相比，谷氨酸10 mmol·L－1攻擊24和48 h對星形膠質(zhì)細胞存活率無明顯影響，而攻擊時間延長至72 h時，存活率明顯降低（P＜0.01），從正常對照組的100%降低到82.0%。

Fig.2 Effect of glutamate 10 mmol·L－1 on cultured cortical astr ocytes viability.±s，n＝5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 谷氨酸對星形膠質(zhì)細胞凋亡和壞死的影響

如圖3 Hoechst33342和PI核熒光雙染結(jié)果顯示，谷氨酸10 mmol·L－1攻擊星形膠質(zhì)細胞24 h不引起細胞凋亡或壞死（圖3B），攻擊72 h星形膠質(zhì)細胞開始死亡，并且主要以凋亡為主（圖3C），凋亡率從正常對照組的（3.70±0.58）% 增加到（24.75±6.76）%（圖3D，P＜0.01）。

Fig.3 Effect of carnosine 10 mmol·L－1 on glutamate－induced apoptosis in cultured cortical astrocytes measured by Hoechst33342／PI staining.A：control；B：after 24 h attack；C：after 72 h attack，respectively.D was the semiquantitative result of A－C.±s，n＝5.＊＊P＜0.01，compared with nor mal control group.

2.4 肌肽對高谷氨酸環(huán)境下星形膠質(zhì)細胞GLT－1和GLAST表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，谷氨酸10 mmol·L－1攻擊星形膠質(zhì)細胞24 h，GLT－1（圖4 A2）和 GLAST（圖4C2）均有輕微的表達上調(diào)，但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖4B，4D）。給予肌肽5 mmol·L－1預(yù)處理30 min再進行谷氨酸攻擊，星形膠質(zhì)細胞GLT－1的表達顯著上調(diào)（圖4 A3，4B），比谷氨酸組上升24.08%（P＜0.05）；GLAST的表達則沒有發(fā)生明顯變化（圖4C3，4D）。

2.5 肌肽對高谷氨酸環(huán)境下星形膠質(zhì)細胞GLT－1 mRNA和GLAST mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

實時定量PCR結(jié)果顯示，肌肽處理后能上調(diào)高谷氨酸環(huán)境下星形膠質(zhì)細胞GLT－1 mRNA表達（與正常對照組相比上調(diào)81.5%，圖5 A），但對GLAST mRNA表達無影響（圖5B）。給予肌肽5 mmol·L－1分別單獨處理正常培養(yǎng)狀態(tài)下的星形膠質(zhì)細胞1～5 d，對 GLT－1 mRNA 和 GLAST mRNA表達均無顯著影響（圖5C，D）。

2.6 肌肽對谷氨酸攻擊后星形膠質(zhì)細胞谷氨酸攝取能力的影響

HPLC檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過肌肽5 mmol·L－1預(yù)處理30 min后，星形膠質(zhì)細胞胞外谷氨酸含量為（0.60±0.08）mmol·L－1，明顯低于谷氨酸組（0.81±0.10）mmol·L－1（P＜0.01），提示肌肽預(yù)處理能顯著提高星形膠質(zhì)細胞對胞外谷氨酸的攝取能力。

Fig.4 Effect of carnosine on expression of glutamate transporter－1（GLT－1）（A and B）and glutamate aspartate transporter（GLAST）（C and D）in cultured cortical astrocytes injured by glutamate by immunohistochemistry assay.Astrocytes were pre－treated with carnosine 5 mmol·L－1 for 30 min and then exposed to glutamate 10 mmol·L－1 for 24 h attack.A1 and C1：nor mal control；A2 and C2：glutamate 10 mmol·L－1 for 24 h attack group；A3 and C3：carnosine 5 mmol·L－1＋glutamate 10 mmol·L－1 group.B was the semi－quantitative result of A1－A3；D was the semiquantitative result of C1－C3.±s，n＝6－9.＊P＜0.05，compared with glutamate treat ment group.

3 討論

有研究報道腦缺血、腦外傷等情況下產(chǎn)生的腦內(nèi)高濃度谷氨酸可能對星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生損傷作用。如Chen等［14］發(fā)現(xiàn)，谷氨酸10 mmol·L－1攻擊星形膠質(zhì)細胞24 h導(dǎo)致細胞嚴(yán)重損傷。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸0～50 mmol·L－1攻擊72 h以內(nèi)都不引起星形膠質(zhì)細胞的損傷［15］。因此，本研究首先采用10 mmol·L－1谷氨酸分別攻擊皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞1～3 d，發(fā)現(xiàn)48 h內(nèi)不引起細胞發(fā)生明顯的死亡和代謝損傷；但隨著谷氨酸攻擊時間的延長星形膠質(zhì)細胞則發(fā)生以凋亡為主的死亡，提示不同的細胞培養(yǎng)條件或不同的培養(yǎng)液成分可能會影響谷氨酸對星形膠質(zhì)細胞的損傷作用。

在哺乳動物的腦內(nèi)，肌肽由少突膠質(zhì)細胞合成，當(dāng)受到外界刺激時少突膠質(zhì)細胞又可再釋放出肌肽，而釋放出來的肌肽可被星形膠質(zhì)細胞通過能量依賴的二肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)所攝取。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細胞肌肽的釋放受谷氨酸受體調(diào)節(jié)［7，16－17］。因此，推測在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，肌肽、谷氨酸信號以及星形膠質(zhì)細胞之間可能存在密切相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，單獨谷氨酸攻擊星形膠質(zhì)細胞24 h不引起GLT－1和GLAST表達的顯著性改變；而給予肌肽預(yù)處理則能顯著上調(diào)GLT－1的表達。但對于肌肽處理后為什么只選擇性地作用于GLT－1，而對GLAST的表達不起作用，目前尚未得到相關(guān)實驗數(shù)據(jù)可以解釋其理由。在小鼠永久性局灶性大腦中動脈阻塞（per manent middle cerebral arter y occl usion，p MCAO）模型上也發(fā)現(xiàn)，肌肽可逆轉(zhuǎn)p MCAO導(dǎo)致的GLT－1表達下調(diào)，而對GLAST表達不起作用，推測可能與GLT－1和GLAST在腦內(nèi)的分布特點相關(guān)［9］。通過實時PCR結(jié)果可以得出，肌肽對GLT－1表達的調(diào)節(jié)作用只發(fā)生于細胞外高谷氨酸環(huán)境下，而對于低谷氨酸條件下不起作用，表明面對突然升高的胞外谷氨酸，星形膠質(zhì)細胞可能通過上調(diào)GLT－1的表達以達到加速清除胞外谷氨酸的目的。

此外，本研究結(jié)果顯示，肌肽能夠促使星形膠質(zhì)細胞快速攝取胞外谷氨酸。根據(jù)以往文獻報道，谷氨酸轉(zhuǎn)運體表達上調(diào)或這些轉(zhuǎn)運體重新由胞質(zhì)內(nèi)分配組裝到細胞膜上均可上調(diào)星形膠質(zhì)細胞對胞外谷氨酸的攝取能力［12］。但是由于肌肽和谷氨酸處理的時間非常短，沒有足夠的時間供新的谷氨酸轉(zhuǎn)運體從頭合成。因此，推測肌肽可能通過調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運體在細胞胞質(zhì)內(nèi)和細胞膜上的重新分布從而促使星形膠質(zhì)細胞快速提高攝取胞外谷氨酸的能力。然而，現(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)尚不能證明以上的推測。肌肽是否能夠促使星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體在細胞內(nèi)的重新分布將是下一步研究的重點。

總之，本研究結(jié)果顯示，肌肽在高谷氨酸環(huán)境下能調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞谷氨酸信號傳遞，提示在腦缺血、腦外傷等疾病過程中肌肽可能通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞GLT－1介導(dǎo)的谷氨酸轉(zhuǎn)運能力而達到減輕腦損傷的作用，表明肌肽可能是一種潛在的防治谷氨酸興奮性損傷的藥物。

［1］Rossi DJ，Brady JD，Mohr C.Astr ocyte metabolis m and signaling during brain ische mia［J］.Nat Neur osci，2007，10（11）：1377－1386.

［2］Barreto G， White RE， Ouyang Y， Xu L，Giffar d RG.Astr ocytes：targets for neuroprotection in stroke［J］.Cent Nerv Syst Agents Med Chem，2011，11（2）：164－173.

［3］Sidor yk－Wegrzyno wicz M，Wegrzynowicz M，Lee E，Bowman AB，Aschner M.Role of astrocytes in brain f unction and disease［J］.Toxicol Pat hol，2011，39（1）：115－123.

［4］Sheldon AL，Robinson MB.The r ole of gluta mate transporters in neurodegenerative diseases and potential opportunities f or inter vention［J］.Neur ochem Int，2007，51（6－7）：333－355.

［5］Ouyang YB，Voloboueva LA，Xu LJ，Giffard RG.Selective dysf unction of hippoca mpal CA1 astrocytes contributes to delayed neuronal da mage after transient f orebrain ischemia［J］.J Neur osci，2007，27（16）：4253－4260.

［6］Rot hstein JD，Patel S，Regan MR，Haenggeli C，Huang YH，Bergles DE，et al.Beta－lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing gl uta mate transporter expression［J］.Nature，2005，433（7021）：73－77.

［7］Bakar djiev A，Bauer K.Biosynt hesis，release，and uptake of car nosine in pri mary cult ures［J］.Biochemistry （Mosc），2000，65（7）：779－782.

［8］Cr ush KG.Car nosine and related substances in ani mal tissues［J］.Comp Biochem Physiol，1970，34（1）：3－30.

［9］Shen Y，He P，F(xiàn)an YY，Zhang JX，Yan HJ，Hu WW，et al.Car nosine protects against per manent cerebral ischemia in histidine decarboxylase knockout mice by reducing gl utamate excitotoxicity［J］.Free Radic Biol Med，2010，48（5）：727－735.

［10］Ki m HJ，MagranéJ.Isolation and culture of neurons and astr ocytes fro m t he mouse brain cortex［J］.Met hods Mol Biol，2011，793：63－75.

［11］Livak KJ， Sch mittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real－ti me quantitative PCR and t he 2〔－delta delta C（T）〕method［J］.Methods，2001，25（4）：402－408.

［12］Duan S，Anderson CM，Stein BA，Swanson RA.Gl utamate induces rapid upregulation of astr ocyte gl uta mate transport and cell－surface expression of GL AST［J］.J Neur osci，1999，19（23）：10193－10200.

［13］Jin CL，Yang LX，Wu XH，Li Q，Ding MP，F(xiàn)an YY，et al.Effects of car nosine on amygdaloid－kindled seizures in Sprague－Dawley rats［J］.Neuroscience，2005，135（3）：939－947.

［14］Chen CJ，Liao SL，Kuo JS.Gliotoxic action of gl utamate on cultured astr ocytes［J］.J Neurochem，2000，75（4）：1557－1565.

［15］Leh mann C，Bette S，Engele J.High extracell ular gluta mate modulates expression of gluta mate transporters and glutamine synt hetase in cultured astr ocytes［J］.Brain Res，2009，1297：1－8.

［16］Dieck ST，Heuer H，Ehrchen J，Otto C，Bauer K.The peptide transporter Pep T2 is expressed in rat brain and mediates t he accu mulation of the fl uorescent dipeptide derivative beta－Ala－Lys－Nepsilon－A MCA in astrocytes［J］.Glia，1999，25（1）：10－20.

［17］Hoff mann A M，Bakar djiev A，Bauer K.Car nosine－synt hesis in cultures of rat glial cells is restricted to oligodendr ocytes and car nosine uptake to astrocytes［J］.Neurosci Lett，1996，215（1）：29－32.