王淑顏，汪溪潔，馬 璟

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203)

心臟毒性是藥物研發(fā)過程中需重點(diǎn)考慮的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，1998-2008年，在美國有33%的藥物因其心臟毒性而被撤市［1］，這不僅給患者的用藥安全帶來極大的風(fēng)險(xiǎn)，也給制藥公司帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

實(shí)時(shí)xCELLigence細(xì)胞分析系統(tǒng)(real time xCELLigence analysis system，RTCA)是一種基于電子阻抗的實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測系統(tǒng)，通過細(xì)胞與檢測板底部電極的相互作用，可在近似生理環(huán)境下連續(xù)幾天至幾周實(shí)時(shí)、無標(biāo)記、非侵入性動(dòng)態(tài)地記錄細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和細(xì)胞形態(tài)的變化，為全面了解細(xì)胞的活性和運(yùn)動(dòng)性提供了一個(gè)更加精確、敏感的檢測平臺(tái)，可在新藥研發(fā)的早期，合成出少量先導(dǎo)化合物階段進(jìn)行心臟毒性的評(píng)價(jià)，具有良好的應(yīng)用前景。本文對(duì)RTCA的基本原理和其在藥物心臟毒性篩選中的應(yīng)用作一綜述。

1 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)的基本原理

RTCA是一種基于非標(biāo)記性、非侵入性、動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析檢測技術(shù)。1984年，Giaever和Keese［2］首次報(bào)道了利用電子阻抗技術(shù)無標(biāo)記地檢測細(xì)胞反應(yīng)。在過去的20多年里，許多報(bào)道描述了使用此技術(shù)來監(jiān)測細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞的黏附、傳播和活化［3］，細(xì)胞形態(tài)和由多種因素造成的形態(tài)改變［4-5］，細(xì)胞遷徙［6］和細(xì)胞對(duì)毒性化合物的反應(yīng)［7-8］，此技術(shù)在細(xì)胞生物領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。如Kustermann等［9］運(yùn)用RTCA監(jiān)測NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞的毒性和增殖能力，來鑒別細(xì)胞抑制劑、細(xì)胞毒藥物和非毒性藥物。Irelan等［10］利用此技術(shù)定量的檢測細(xì)胞的質(zhì)量特性及功能，Ke等［11］監(jiān)測HeLa細(xì)胞的生存能力等。2011年，由美國艾森生物和羅氏共同推出了xCELLigence RTCA Cardio(以下簡稱Cardio)，它可以記錄體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞搏動(dòng)的頻率、節(jié)律、振幅、搏動(dòng)持續(xù)時(shí)間以及搏動(dòng)頻率的不規(guī)則指數(shù)等指標(biāo)。對(duì)藥物引起的心肌細(xì)胞毒性有了更全面的認(rèn)識(shí)，這種新的研究手段，用特征性的心肌細(xì)胞搏動(dòng)圖譜反映心律失常，這是傳統(tǒng)電生理學(xué)研究方法所不能實(shí)現(xiàn)的。

RTCA由4部分組成，即電子微量滴定板、細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測阻抗記錄單元、實(shí)時(shí)細(xì)胞分析單元和實(shí)時(shí)細(xì)胞數(shù)據(jù)處理及阻抗轉(zhuǎn)換為細(xì)胞指數(shù)單位［12-14］。該系統(tǒng)將微電極細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞貼附與生長檢測板的底部。微電極阻抗主要是由點(diǎn)及周邊離子環(huán)境所決定，當(dāng)電場加在上面時(shí)即可測得一個(gè)基線阻抗。細(xì)胞的有無以及貼壁程度的改變都會(huì)影響電極傳感器表面電子和離子的通過。無細(xì)胞時(shí)，檢測孔底部排列的微電極陣列的阻抗分布近似均勻;加入細(xì)胞后，細(xì)胞和電極表面接觸黏附，影響電極溶液間的離子環(huán)境，導(dǎo)致阻抗的升高，細(xì)胞越多，阻抗增加越高，這種阻抗的變化即可通過算法換算成細(xì)胞指數(shù)表示。細(xì)胞在上述表面上的貼壁或生長可引起各個(gè)陣列的電極結(jié)構(gòu)的阻抗變化，細(xì)胞貼壁程度緊密與否也會(huì)使電阻抗發(fā)生變化。因此，黏附在電極表面的細(xì)胞越多，細(xì)胞指數(shù)越大(圖1)。同樣，細(xì)胞與電極表面黏附越緊密伸展，電阻抗增加越大。測得的電極間的阻抗反映關(guān)于電極上細(xì)胞生物狀態(tài)的重要信息。當(dāng)細(xì)胞的生物狀態(tài)發(fā)生變化時(shí)，系統(tǒng)即可實(shí)時(shí)并自動(dòng)獲取模擬電信號(hào)，并轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號(hào)進(jìn)行進(jìn)一步分析。因此，電阻抗即為細(xì)胞指數(shù)值，反映細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態(tài)［15］。

圖1 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)(RTCA)原理圖.

基于上述原理，將心肌細(xì)胞接種于含有微電極的培養(yǎng)板上，當(dāng)心肌收縮和舒張時(shí)，引起阻抗變化，將阻抗變化換算成細(xì)胞指數(shù)，在10 kHz時(shí)，細(xì)胞指數(shù) =(樣本阻抗-基線阻抗)/15，即可觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、節(jié)律幅度以及活性的變化。Cardio將所得的數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件分析系統(tǒng)分析其心率變異性(heart rate variability，HRV)。HRV 的 Poincaréplots是以RR間期序列{RRi}(i=1，2，……，N)中的相鄰兩點(diǎn)(RRi，RRi+1)為坐標(biāo)在圖中用散點(diǎn)標(biāo)記出逐拍心跳。大量的散點(diǎn)形成一個(gè)相對(duì)密集的散點(diǎn)區(qū)域，其不同形態(tài)反映了不同的心率變異信息［16］。通常情況下，Poincaréplots所用的3個(gè)指數(shù)為:SD1，即短軸表示RR間期短時(shí)變化的標(biāo)準(zhǔn)差;SD2，即長軸表示RR間期長時(shí)變化的標(biāo)準(zhǔn)差;R，即軸率(R=SD1/SD2)?？菇M胺類藥物特非那定其潛在的hERG通道阻滯作用，引起QT間期延長，導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速(圖2A，B)而被撤出市場。特非那定并不引起明顯的振幅變化(圖2C)，卻引起明顯的搏動(dòng)幅度的峰值時(shí)間的下降(圖2D)所示。給予特非那定0.1μmol·L-1后，和對(duì)照組相比，SD1 由12.6 下降到6.2 ms，SD2 由101.5 下降到49.4 ms;而給予特非那定10μmol·L-1后，SD1和SD2分別增長到21.2和172.9 ms(圖2E)。通過以上指數(shù)證實(shí)，高濃度的特非那定使人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)心肌細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte，hiPSC-CM)的搏動(dòng)信號(hào)極其不規(guī)則［17］。由此可見，Cardio可以檢測潛在的QT間期延長、心臟沖動(dòng)形成和傳導(dǎo)異常導(dǎo)致的心律失常，預(yù)測藥物對(duì)心肌細(xì)胞潛在的毒性。

2 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)在藥物心臟毒性篩選中的應(yīng)用

心律失常是藥物導(dǎo)致心臟毒性的主要原因，由于心肌細(xì)胞膜上鈉、鉀、鈣離子的定向性和選擇性運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生電荷、協(xié)調(diào)心肌細(xì)胞的收縮，所以，任何干擾這些離子通道的藥物均有可能導(dǎo)致心律異常［18］。傳統(tǒng)的電生理學(xué)研究方法操作復(fù)雜，不能對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行長時(shí)間持續(xù)性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，且對(duì)非離子通道藥物可能引起的心臟毒性無法監(jiān)測;而體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本高、周期長、工作量大以及需用的化合物量大無法完成高通量檢測。

圖2 特非那定對(duì)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞(hiPS-CM)活性變化的影響［12］.A:搏動(dòng)曲線;B:搏動(dòng)比率;C:Poincaréplots分析的搏動(dòng)信號(hào)振幅的分布;D:自發(fā)性心肌細(xì)胞搏動(dòng)幅度的達(dá)峰時(shí)間;E:達(dá)峰時(shí)間.

Cardio將基于阻抗的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)運(yùn)用到心臟毒性的檢測領(lǐng)域，相對(duì)于傳統(tǒng)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法，它可以在近似生理的細(xì)胞環(huán)境下持續(xù)短時(shí)或長時(shí)的監(jiān)測心肌細(xì)胞的搏動(dòng)情況、生理狀態(tài)以及活力改變，快速獲得更多有效及重要的數(shù)據(jù)，從而保證了實(shí)驗(yàn)的持續(xù)性、重復(fù)性和數(shù)據(jù)的質(zhì)量。有效避免假陰性，具有高的特異性和靈敏性，相對(duì)簡單的操作。能更多使用生理學(xué)相關(guān)細(xì)胞而非基因工程細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果的可信性更高，通量更大，且可長時(shí)間監(jiān)測。因此，該系統(tǒng)可在早期檢測離子通道及非離子通道藥物的心肌細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，預(yù)測藥物潛在的心臟毒性，為藥物心臟毒性的安全性評(píng)價(jià)及優(yōu)化提供了嶄新的平臺(tái)。

2.1 Cardio檢測的各種指標(biāo)與心臟毒性的關(guān)系

心率是Cardio監(jiān)測的主要指標(biāo)，傳統(tǒng)上心率是指心臟每分鐘搏動(dòng)的次數(shù)，在此是指心肌細(xì)胞每分鐘搏動(dòng)的次數(shù)。心率與藥物的心臟毒性有著密切的關(guān)系，因?yàn)樾穆试黾涌梢鸲喾N疾病。Inoue等［19］報(bào)道，隨著心率的升高，高血壓的發(fā)病率不斷增加。有研究表明，靜息心率可作為冠心病的預(yù)測因子，INVEST研究表明，高血壓伴有冠心病的老年患者，基礎(chǔ)心率比較高，用維拉帕米或阿替洛爾治療后，靜息心率過高或者過低，均增加死亡風(fēng)險(xiǎn)［20］。心率增加還可引起多種嚴(yán)重的心臟疾病，如心肌梗死［21］、心房顫動(dòng)［22-23］及心力衰竭［24］等。

節(jié)律也是Cardio監(jiān)測的主要指標(biāo)之一。體內(nèi)試驗(yàn)中，節(jié)律是指心電監(jiān)測儀上呈現(xiàn)出的心臟搏動(dòng)的節(jié)奏和規(guī)律;在Cardio監(jiān)測的體外實(shí)驗(yàn)中，節(jié)律是指心肌細(xì)胞搏動(dòng)的節(jié)奏和規(guī)律。節(jié)律異常的表現(xiàn)形式多種多樣，早后除極是最常見的節(jié)律紊亂，也是誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速的主要因素［25］。而慢性心力衰竭與心肌細(xì)胞的節(jié)律和收縮性有著密切的關(guān)系［26］。

Cardio系統(tǒng)還可以測得心肌細(xì)胞搏動(dòng)的幅度，這個(gè)測量指標(biāo)在心肌細(xì)胞搏動(dòng)圖譜上被定義為一個(gè)負(fù)峰值和下一個(gè)正峰值之間的距離。2個(gè)正峰值之間的時(shí)間被稱之為心肌細(xì)胞的搏動(dòng)間期，這兩個(gè)指數(shù)均與心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)間期相對(duì)應(yīng)。該系統(tǒng)還可以測得3個(gè)與時(shí)間相關(guān)的參數(shù)，在心肌細(xì)胞搏動(dòng)圖譜上被稱之為上升時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間和衰減時(shí)間，呈現(xiàn)出心肌細(xì)胞搏動(dòng)的時(shí)間特征。由Cardio及Poincaréplots分析系統(tǒng)提供的關(guān)于HRV即逐次心跳的RR間期間存在的微小差異或漲落現(xiàn)象的數(shù)據(jù)，為藥物心臟毒性的評(píng)價(jià)，提供了更加精確的信息。HRV受心臟交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)等多種因素的影響，交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)時(shí)HRV減小，副交感神經(jīng)活動(dòng)增加時(shí)HRV增加。多種心臟疾病于交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的緊張性和均衡性有關(guān)系，如急性心肌梗死、心力衰竭患者的交感神經(jīng)張力升高，副交感神經(jīng)張力下降［27］。

2.2 Cardio在心臟毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

Cardio系統(tǒng)是藥物臨床前早期篩選的一個(gè)重要工具，能將心肌細(xì)胞對(duì)引起心律失常的藥物的響應(yīng)用特征性的搏動(dòng)圖譜呈現(xiàn)，進(jìn)而檢測時(shí)間分辨率。該系統(tǒng)結(jié)合心肌細(xì)胞的物理搏動(dòng)特性，可以非常簡便地檢測此類藥物的作用。同時(shí)，通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測保證了心肌細(xì)胞瞬時(shí)響應(yīng)及長時(shí)效應(yīng)的獲取。該方法通過實(shí)時(shí)記錄分析藥物的心率、節(jié)律及HRV的變化，更加精確，敏感地評(píng)價(jià)藥物的心臟毒性，有效地降低傳統(tǒng)終點(diǎn)法和單一離子通道等檢測方法的假陰性率，減少了藥物心臟毒性給制藥公司帶來的經(jīng)濟(jì)損失。Cardio可用于原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)心肌細(xì)胞(embryonic stem cellderived cardiomyocyte，ESC-CM)、hiPSC-CM、小鼠 iPSC-CM(miPSC-CM)的研究，檢測藥物對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用。如表1所示，最近，Jonsson等［28］利用Cardio系統(tǒng)檢測多種已知作用的化合物對(duì)hiPSC-CM和mESC-CM的作用，并得到精確的結(jié)果，證明了該系統(tǒng)可以全面精確地檢測化合物的心臟毒性。如L-型Ca2+通道阻滯劑氨氯地平在第2次給藥后引起人iPSC-CM搏動(dòng)消失，在第1次給藥后引起小鼠ESC-CM搏動(dòng)消失，這說明給藥濃度太高，而出現(xiàn)急性毒性。T-型Ca2+通道阻滯劑米貝地爾在2次給藥后基本不影響人iPSC-CM的搏動(dòng)情況;在第1次給藥后抑制2個(gè)平行劑量組大鼠ESC-CM的搏動(dòng)，在第2次給藥后抑制了所有(6個(gè)平行劑量組)大鼠ESC-CM的搏動(dòng)。hERG通道抑制劑E-4031，在第1次給藥后引起人iPSC-CM搏動(dòng)的次數(shù)由基礎(chǔ)值44±1降為22±3，降低了45%并伴有5個(gè)平行劑量組的搏動(dòng)不規(guī)則，在第2次給藥后2個(gè)平行劑量組出現(xiàn)搏動(dòng)不規(guī)則，2個(gè)平行劑量組搏動(dòng)的振幅＜0.02CI;大鼠ESC-CM的搏動(dòng)次數(shù)在第1次給藥后由177±5降為161±8，降低了9%并有2個(gè)平行劑量組搏動(dòng)不規(guī)則，在第2次給藥后，降為153±10，降低了15%且搏動(dòng)不規(guī)則消失。這7種化合物分別作用于不同的靶點(diǎn)，給予不同濃度的藥物后，Cardio均能精確地檢測出它們對(duì)hiPSC-CM和mESC-CM心率的影響。同時(shí)，Nguemo等［17］應(yīng)用 Cardio和 Poincaréplots分析系統(tǒng)評(píng)價(jià)了異丙腎上腺素、卡巴膽堿、特非那丁、索他洛爾和多柔比星的心臟毒性，并聯(lián)合了膜片鉗技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。Cardio可以在近似生理環(huán)境下同時(shí)監(jiān)測藥物對(duì)多個(gè)離子通道作用，以及藥物物之間的相互作用，且具有高通量性、高特異性和高敏感性。

表1 兩種濃度的7種化合物對(duì)hiPSC-CM和大鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)心肌細(xì)胞(mESC-CM)心率的影響［28］

Abassi等［29］利用Cardio預(yù)測藥物(離子通道調(diào)節(jié)劑、hERG通道抑制劑、誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)心率失常的藥物等)的臨床前心臟毒性。如運(yùn)用Cardio記錄mESC-CM給予L-型鈣離子通道阻滯劑伊拉地平(isradipine)、hERG通道抑制劑E4301、鈉離子通道抑制劑河豚毒素、β-受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素后，24 h心肌細(xì)胞的搏動(dòng)情況。第1小時(shí)每分鐘記錄1次，第2小時(shí)每5 min記錄1次，第3～24小時(shí)每15 min記錄1次，每次記錄時(shí)間為20 s。Cardio軟件分析獲得數(shù)據(jù)，計(jì)算搏動(dòng)的次數(shù)、節(jié)律、幅度以及搏動(dòng)持續(xù)時(shí)間等，為評(píng)價(jià)藥物的早期心臟毒性提供大量的信息。該系統(tǒng)敏感、定量地檢測出了影響心臟調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)，包括一些被傳統(tǒng)電生理學(xué)方法所遺漏的藥物。另外，該系統(tǒng)還被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、凋亡、死亡和G蛋白耦聯(lián)受體激動(dòng)作用的監(jiān)測［30］。

綜上所述，Cardio可以在早期敏感而準(zhǔn)確地檢測出藥物潛在的心臟毒性，該心肌細(xì)胞分析系統(tǒng)已迅速地被藥物企業(yè)及生物技術(shù)公司接受。當(dāng)前輝瑞、羅氏和GSK等國外大型制藥公司都以開始使用此技術(shù)進(jìn)行藥物和候選化合物常規(guī)心臟毒性的篩選研究，并進(jìn)行了聯(lián)合驗(yàn)證，準(zhǔn)備向FDA和ICH推薦此技術(shù)，希望能把該技術(shù)列為和hERG技術(shù)同等重要的地位。美國FDA在2012年10月購買了Cardio實(shí)時(shí)心肌細(xì)胞分析系統(tǒng)，這正是該系統(tǒng)被制藥領(lǐng)域認(rèn)可的延伸表現(xiàn)。

3 展望

近年來，越來越多的技術(shù)應(yīng)用于藥物心臟毒性篩選和評(píng)價(jià)中。Cardio作為一個(gè)新興的技術(shù)，具有高敏感性、高通量、低成本和高效率等優(yōu)點(diǎn)，通過在近似生理環(huán)境下，實(shí)時(shí)記錄分析心肌細(xì)胞的搏動(dòng)情況、形態(tài)改變等，可以早期預(yù)測和評(píng)價(jià)藥物潛在的心臟毒性，降低新藥研發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。但該方法也存在局限性，Cardio無法清楚解釋藥物是通過何種途徑(如鉀、鈉、鈣離子通道，心肌細(xì)胞壞死等)誘發(fā)心臟毒性，尚不能取代傳統(tǒng)的電生理學(xué)研究方法。如能將Cardio技術(shù)與電生理學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)及組學(xué)技術(shù)等有機(jī)地結(jié)合運(yùn)用，相互補(bǔ)充，取長補(bǔ)短，必將能更加全面深入地預(yù)測和評(píng)價(jià)各種離子通道和非離子通道藥物引起的心臟毒性，從而更加有效地降低新藥研發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

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