毛侃瑯，徐新云，何曉陽，毛吉炎，張 然，謝 杏，秦逍云

（1.深圳市疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理學(xué)重點實驗室／深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點實驗室，廣東 深圳 518055；2.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實驗室／深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 深圳 518060）

工業(yè)上三氯乙烯常用于金屬的脫脂劑和脂肪、油及石蠟等的萃取劑，也用于冷凍劑、殺菌劑及衣服干洗劑等。近年來三氯乙烯引起部分接觸者嚴(yán)重的皮膚和肝損害甚至死亡的報道日益增多［1－3］。三氯乙烯接觸者的發(fā)病存在明顯的個體差異，這可能與不同個體通過肝代謝三氯乙烯后的產(chǎn)物不同有關(guān)。細(xì)胞色素P450酶（cytochro me P450，CYP）是一類重要的肝氧化代謝酶，很多藥物、環(huán)境毒物和職業(yè)毒物等都是通過CYP進行代謝。其中CYP3 A4占總CYP酶的30%～40%，參與多種環(huán)境污染物和藥物的代謝過程［4－5］。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，三氯乙烯可引起CYP3A4表達明顯改變，CYP3 A4可能在三氯乙烯代謝中起重要作用［3］。因此，本實驗通過慢病毒載體技術(shù)構(gòu)建CYP3 A4高表達肝細(xì)胞株，并觀察其對三氯乙烯毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、質(zhì)粒和細(xì)胞

限制性內(nèi)切酶XmaⅠ和T4 DNA連接酶，購自美國Fer mentas公司；DNA膠回收試劑盒和RNeasy Mini試劑盒，購自德國Qiagen公司；Premix Pri me STAR HS、Ex Taq酶、Pri meScript RT試劑盒，SYBR Pri mescript RT－PCR試劑盒和核酸共沉劑，購自大連Ta Ka Ra公司；p GM－T載體和Top10感受態(tài)細(xì)菌，購自北京天根公司；質(zhì)粒小量提取和無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒，購自美國OMEGA Bio－Tek公司；p LVX－ac GFP1－C1質(zhì)粒（以下簡稱p LVX載體）和該質(zhì)粒對應(yīng)的慢病毒包裝試劑盒，購自美國Clontech公司；用于慢病毒包裝的293FT細(xì)胞，購自美國Invitr ogen公司；RPMI1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清，購自美國Gibco公司；正常人L02肝細(xì)胞，購自中國上海細(xì)胞庫。CYP3 A4一抗購于美國Santa Cruz公司，兔抗小鼠二抗購于美國Ther mo Scientific公司。

1.2 CYP3A4 c DNA的擴增及其TA克隆載體構(gòu)建

根據(jù)Gen Bank的CYP3 A4基因序列對所需引物進行設(shè)計，正向：CATCCCAGACTT－3′， 反 向：按照Premix Pri meSTAR HS的使用說明配置反應(yīng)體系，以帶CYP3 A4基因的p Fast Bac－3 A4載體為模板進行PCR，退火溫度為62℃。PCR完成后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并再用Ex Taq酶進行加A尾反應(yīng)。按照p GM－T載體的說明書，將加A尾產(chǎn)物與p GM－T載體連接，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)菌。常規(guī)篩選鑒定，挑取小量培養(yǎng)的PCR鑒定陽性克隆的細(xì)菌菌液，由上海生工測序。

1.3 慢病毒載體構(gòu)建與包裝

挑取測序正確的重組T載體，先進行XmaⅠ酶切，用核酸共沉劑回收酶切產(chǎn)物后，再用XhoⅠ酶切。電泳鑒定后，用DNA膠回收試劑盒回收第二步的酶切產(chǎn)物，然后將其與經(jīng)過相同處理的p LVX載體連接，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)菌。小量培養(yǎng)篩選出來的細(xì)菌，提取重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，并將菌液送至上海生工測序。挑取測序正確的重組p LVX載體，用p LVX載體對應(yīng)的慢病毒包裝試劑盒將p LVX載體和包裝載體共轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，37℃，5%CO2培養(yǎng)48 h后將上清培養(yǎng)基用0.45 μm濾膜過濾，收集病毒上清，用慢病毒包裝試劑盒內(nèi)的Lenti－X GoStix金標(biāo)試紙條對病毒的滴度進行測定，試紙條的C條帶和T條帶均出現(xiàn)，說明病毒滴度＞5×109IFU·L－1，足夠感染L02細(xì)胞。該病毒上清用于轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞

將L02細(xì)胞（約4×105個）接種于25 c m2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，18 h后細(xì)胞融合度達到50%左右，取病毒上清2.5 ml，加入RPMI1640完全培養(yǎng)基2.5 ml（按1∶1稀釋），再加入聚凝膠至終濃度6～10 mg·L－1。去除培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)基，用PBS洗2次后加入上述含慢病毒的RPMI1640完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h，去除含慢病毒的RPMI1640完全培養(yǎng)基，加入正常的RPMI1640完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，用嘌羅霉素0.5 mg·L－1對細(xì)胞進行篩選，篩選時間為7 d。細(xì)胞培養(yǎng)條件是37℃，5%CO2，每2 d更換培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞株20代再進行PCR和Wester n蛋白質(zhì)印跡鑒定，細(xì)胞仍然穩(wěn)定表達即作為CYP3 A4高表達肝細(xì)胞株。

1.5 CYP3A4高表達肝細(xì)胞株的鑒定

1.5.1 熒光定量PCR檢測CYP3A4基因mRNA

分別接種正常L02細(xì)胞和1.4所述重組慢病毒轉(zhuǎn)染并經(jīng)嘌羅霉素7d處理后的存活細(xì)胞至6孔板（約1×105個），培養(yǎng)細(xì)胞約20 h至融合度80%。按照產(chǎn)品指南，用RNeasy Mini試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用Pri meScript RT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA。分別取正常細(xì)胞和高表達肝細(xì)胞的c DNA各1μl為模板進行熒光定量PCR，檢測CYP3 A4基因的表達量變化。以2－ΔΔCt表示目的基因的相對表達水平。

1.5.2 Wester n蛋白質(zhì)印跡法檢測CYP3A4蛋白表達量

將正常L02細(xì)胞、CYP3 A4高表達肝細(xì)胞分別接種到兩個25 c m2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中（約1×106個）。培養(yǎng)約20 h，待細(xì)胞融合度達90%后去除培養(yǎng)基，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液200μl，在冰上孵育3 min后用細(xì)胞刮將細(xì)胞快速刮下，收集到500μl管中，然后置于冰上繼續(xù)裂解20 min，16 000×g，4℃離心30 min，取上清，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)上樣量30μg，最后加入5×SDS－PAGE 上樣緩沖液，100℃變性5 min。樣品隨后進行10%SDS－PAGE電泳分離，接著將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉（TBST溶解）室溫封閉2 h。根據(jù)標(biāo)志物和相對分子質(zhì)量將膜上含GAPDH（37 ku）、CYP3 A4蛋白（58 ku）的部分分別切下，加入 CYP3A4一抗（1∶200），室溫孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次（每次10 min），再加入兔抗小鼠二抗（1∶3000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次（每次10 min）后，加入Western蛋白質(zhì)印跡實驗化學(xué)發(fā)光試劑光后用GE冷CCD成像系統(tǒng)對其進行曝光拍照，所得圖像用ImageJ軟件進行條帶灰度定量分析。以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.6 三氯乙烯處理CYP3A4高表達肝細(xì)胞

將正常L02肝細(xì)胞和CYP3A4高表達肝細(xì)胞分別接種到6孔板上，待細(xì)胞融合度達80%進行三氯乙烯染毒。三氯乙烯染毒濃度分別為0（溶劑對照），0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mmol·L－1。染毒12 h，將6孔板中的染毒液去除干凈，用PBS清洗細(xì)胞2次。提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計（A260nm／A280nm）測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR。

1.7 實時熒光定量PCR檢測CYP3A4高表達肝細(xì)胞中各凋亡基因和癌基因mRNA表達水平

提取1.6所述細(xì)胞總RNA，按照Ta Ka Ra的Pri me ScriptTMRT試劑盒配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μl：5×Pri meScript?緩沖液4μl，Pri meScript?RT Enzy me Mix I 1.0μl，1.0μl Oligo d T 引物50μmol·L－1，Rando m 6 mers（100μmol·L－1）1.0μl，總RNA 1μg，加水至20μl。37℃15 min，85℃5 s，4℃10 min，進行逆轉(zhuǎn)錄。－20℃冰箱保存逆轉(zhuǎn)錄樣品。

基因的PCR引物由Ta Ka Ra生物公司合成（表1）。實時熒光定量PCR反應(yīng)按照試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系20μl：SYBR?Pre mix Ex Taq T M （2×）10μl，PCR引物（10μmol·L－1）0.4μl，ROX Reference Dye（50×）0.4μl，c DNA 模板 1 μl，d H2O 7.8μl。凋亡基因（bcl－2，胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9）實時熒光定量PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 s，1個循環(huán)；接著95℃變性5 s，58℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)；癌基因（c－fos、c－myc、k－ras和 p53）的 PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 s，1個循環(huán)；接著95℃變性5 s，54℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。

Tab.1 RT fluorescent quantitative PCR pri mers of target genes

以GAPDH的Ct值為內(nèi)參，目的基因Ct值采用2－△△Ct法計算各基因的相對表達量，此步驟由ABI 7900 HT分析軟件自動計算并直接給出結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CYP3A4慢病毒重組載體構(gòu)建與病毒包裝鑒定

應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分析CYP3A4基因的PCR擴增產(chǎn)物，可見非常明顯條帶，大小約1500 bp，與預(yù)期相符。將含PCR產(chǎn)物的重組p GMT載體經(jīng)上海生工測序，與Gen Bank上該基因的序列完全相符。將該片段從T載體上切下，與p LVX載體連接后進行測序，也與預(yù)期完全相符。

2.2 CYP3A4高表達肝細(xì)胞株中CYP3A4基因的表達

將正常L02細(xì)胞的CYP3 A4基因表達量作為對照，數(shù)值設(shè)為1，CYP3 A4高表達肝細(xì)胞的CYP3 A4基因表達量比正常L02細(xì)胞提高94倍。

2.3 CYP3A4高表達肝細(xì)胞株中的CYP3A4蛋白表達水平

以GAPDH蛋白為內(nèi)參，檢測正常L02細(xì)胞和CYP3 A4高表達肝細(xì)胞CYP3A4蛋白表達水平，經(jīng)歸一化處理后的灰度分析結(jié)果顯示（圖1），高表達肝細(xì)胞CYP3 A4蛋白含量是正常L02肝細(xì)胞的2.36倍。

Fig.1 CYP3A4 protein expression in CYP3A4 overexpressed hepatocytes detected by Wester n blotting.Lane 1：L02 cells；lane 2：blank control；lane 3：CYP3 A4 overexpressed hepatocytes.±s，n＝3.＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal L02 cells.

2.4 三氯乙烯對CYP3A4高表達肝細(xì)胞中凋亡基因mRNA表達的影響

如圖2所示，與正常L02細(xì)胞相比，三氯乙烯0.25和0.5 mmol·L－1使CYP3 A4高表達肝細(xì)胞中的bcl－2 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.01），但隨著三氯乙烯劑量的升高與正常細(xì)胞無明顯差異。與正常肝細(xì)胞相比，三氯乙烯0.5，1.0，2.0和4.0 mmol·L－1使CYP3 A4高表達肝細(xì)胞中胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的mRNA表達 都 顯 著 升 高 （P＜0.05）， 但 三 氯 乙 烯0.25 mmol·L－1雖使胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的mRNA的表達有所升高，但與正常對照組無顯著差異。

Fig.2 Effect of trichloroethylene on apoptosis gene expression in CYP3A4 overexpressed hepatocytes.The cells were treated wit h TCE f or 12 h.±s，n＝3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal L02 cells at t he sa me trichloroet hylene concentration.

2.5 三氯乙烯對CYP3A4高表達肝細(xì)胞癌基因mRNA表達的影響

與凋亡基因轉(zhuǎn)錄水平變化類似，三氯乙烯對CYP3 A4高表達肝細(xì)胞的癌基因轉(zhuǎn)錄亦產(chǎn)生明顯影響。與正常肝細(xì)胞相比，三氯乙烯0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mmol·L－1使k－ras基因 mRNA 表達明顯升高（P＜0.05），p53 mRNA 表達明顯下降（P＜0.05）；三氯乙烯0.5，1.0，2.0和4.0 mmol·L－1使CYP3 A4高表達肝細(xì)胞中的c－f os和c－myc基因的mRNA表達明顯升高（P＜0.05），但三氯乙烯0.25 mmol·L－1處理無顯著變化（圖3）。

Fig.3 Effect of trichloroethylene on oncogene expression in CYP3A4 overexpressed hepatocytes.See Fig.2 f or cells treatment.±s，n＝3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal L02 cells at t he sa me trichlor oet hylene concentration.

3 討論

本實驗的實時熒光定量PCR和Wester n蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，CYP3 A4高表達載體構(gòu)建非常成功，可以應(yīng)用到三氯乙烯毒性研究中。

本實驗結(jié)果顯示，CYP3 A4高表達肝細(xì)胞中抗凋亡基因bcl－2的表達水平隨三氯乙烯濃度增加而降低，胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9基因表達水平則隨三氯乙烯濃度增加而升高。bcl－2在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起重要作用，其表達可以起到抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而使細(xì)胞的存活率提高，因此，bcl－2基因表達水平下降預(yù)示著細(xì)胞凋亡水平的增高。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)三氯乙烯染毒劑量增至中等劑量以上時，CYP3 A4高表達肝細(xì)胞和正常肝細(xì)胞bcl－2表達水平基本接近，而CYP3 A4高表達肝細(xì)胞胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的mRNA表達水平顯著高于正常肝細(xì)胞，說明低劑量三氯乙烯可以促進CYP3 A4高表達肝細(xì)胞中的抗凋亡基因bcl－2表達，而高劑量時主要是促進胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9基因的表達，推測其原因可能是三氯乙烯在CYP3 A4高表達肝細(xì)胞中具有促進凋亡基因活化的作用。胱天蛋白酶是一組在凋亡中發(fā)揮起始和執(zhí)行作用的蛋白［6］，其中胱天蛋白酶3是最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是凋亡的主要效應(yīng)因子，其活化意味著凋亡進入不可逆階段［7］。胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9則是凋亡的啟動因子，在自我活化后能激活凋亡執(zhí)行。因此，4種凋亡基因表達水平的變化表明，三氯乙烯染毒對CYP3 A4高表達肝細(xì)胞凋亡基因有明顯影響，并且與正常肝細(xì)胞相比，三氯乙烯引起對CYP3 A4高表達肝細(xì)胞的細(xì)胞凋亡有明顯促進作用，是三氯乙烯在肝細(xì)胞代謝中的重要因素之一。

三氯乙烯染毒CYP3 A4高表達肝細(xì)胞后癌基因c－f os，c－myc和k－ras表達水平隨三氯乙烯濃度增加而升高，p53表達水平隨三氯乙烯濃度增加而降低。c－fos，c－myc和k－ras基因均為編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的正常細(xì)胞基因，c－myc和c－fos參與了胞外生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至基因水平的過程，在調(diào)控細(xì)胞分裂的過程中是否從G0期轉(zhuǎn)向G1期中起重要作用［8］；而kras則作為一個“分子開關(guān)”起作用［9］，一旦其處于“開啟”狀態(tài)，就會招募并激活傳播生長因子和其他受體信號所必需的蛋白。當(dāng)受到理化等因素作用而活化時，這些基因表達異常，可導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化或癌變，k－ras屬于原癌基因。p53基因的主要功能是維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定，是一種抑癌基因。

目前，動物實驗已經(jīng)證明三氯乙烯具有致癌性［10－12］，由于當(dāng)時人群流行病學(xué)資料不足，國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）于1995年將三氯乙烯定為“對人類可能致癌物”［13］。2011年9月，IARC在進行了充分的資料收集，之后美國環(huán)保署發(fā)布了針對三氯乙烯的最終健康風(fēng)險評估報告，將其確認(rèn)為致癌物質(zhì)，并且還指出了其對人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎、肝、男性生殖系統(tǒng)以及胎兒發(fā)育都有一定的危害［14］。本實驗結(jié)果顯示，三氯乙烯具有明顯的促進癌基因表達的生物學(xué)作用，而且CYP3 A4高表達肝細(xì)胞比正常肝細(xì)胞的癌基因表達水平更高，提示三氯乙烯可能經(jīng)過肝代謝酶活化，增加了三氯乙烯對癌基因的活化水平，為深入研究三氯乙烯的致癌作用提供了理論依據(jù)。

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