楊能力，梁亞峰，呂 雅，李前君，王均爐

（溫州醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院麻醉科，2.附屬第二醫(yī)院 育英兒童醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)室，浙江 溫州 325000）

哮喘是嚴(yán)重危害人類健康最常見(jiàn)的疾病之一，其患病率一直呈逐年遞增的趨勢(shì)［1］。氣道重塑在哮喘發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但迄今為止，尚未找到一種有效抑制哮喘氣道重塑的藥物。姜黃素（curcu min）在減輕氣道炎癥和抗纖維化方面具有顯著的作用［2－3］，但其在抑制哮喘大鼠氣道重塑的作用及其機(jī)制尚未完全闡明。尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）是一類重要的內(nèi)源性血管活性物質(zhì)，還具有收縮氣管平滑肌和促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖作用，在哮喘的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。我們的前期研究表明，UⅡ在哮喘發(fā)病中呈現(xiàn)時(shí)間依賴性高表達(dá)［5］。本研究通過(guò)觀察姜黃素對(duì)哮喘大鼠的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、血清中UⅡ 及肺組織UⅡmRNA表達(dá)的影響，探討姜黃素抑制哮喘大鼠氣道重塑的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

姜黃素，卵清蛋白（ovalbu min，OVA），美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：076 K7045。大鼠UⅡ酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，美國(guó)R＆D公司。引物合成由上海生物工程技術(shù)有限公司提供。N038型PARI BOY超聲霧化器，德國(guó)百瑞有限責(zé)任公司；Oly mpus光學(xué)顯微鏡，日本光學(xué)儀器有限公司；Leica圖像采集系統(tǒng)及Leica石蠟切片機(jī)，德國(guó)徠卡儀器有限公司；Syner gy2酶聯(lián)檢測(cè)儀，美國(guó)Bio Tek公司。

1.2 大鼠哮喘模型的制備和分組處理［6］

清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量100～120 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司〔許可證編號(hào)SCXK（滬）2008－003〕。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成5組，每組8只：正常對(duì)照組、哮喘模型組和姜黃素50，100和200 mg·kg－1治療組。以進(jìn)行處理的當(dāng)天為第1天，除正常對(duì)照組外，哮喘模型組及姜黃素組在第1天和第8天ip給予1.5 ml OVA／Al（OH）3混合液〔內(nèi) 含 OVA 1 mg 和Al（OH）3100 mg〕，第15天開(kāi)始霧化吸入1%OVA激發(fā)，隔天1次，每次30 min，正常對(duì)照組對(duì)應(yīng)ip給予生理鹽水和霧化吸入。使用0.5%羧甲基纖維素鈉液配制姜黃素混懸液。姜黃素各組從第15天開(kāi)始，每次激發(fā)前30 min分別ig給予姜黃素50，100和200 mg·kg－1，持續(xù)6周，正常對(duì)照組和哮喘模型組ig對(duì)應(yīng)給予0.5%羧甲纖維素鈉液。

1.3 動(dòng)物標(biāo)本的收集

末次霧化吸入12 h內(nèi)，腹腔給予10%水合氯醛（400 mg·kg－1）麻醉，股動(dòng)脈取血，全血離心（4℃，1000×g，離 心 15 min），吸取血清分裝，置于－70℃保存?zhèn)溆?。開(kāi)胸，迅速分離肺組織，結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)氣管行左肺灌洗。10 ml生理鹽水分3次灌洗，約30 s后回收BALF，回收率高于80%，灌洗液處理方法同血清。切取右肺肺門上段肺組織，浸入4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋及切片（厚約5μm），HE染色觀察。

1.4 支氣管管壁厚度和平滑肌厚度測(cè)量

每只大鼠選擇3支直徑1000～1500μm支氣管，用彩色醫(yī)學(xué)圖像分析技術(shù)測(cè)定支氣管基底膜周徑、支氣管總面積、管腔面積、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積和平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積。支氣管壁厚度＝（支氣管總面積－管腔面積）／支氣管基底膜周徑；平滑肌厚度＝（平滑肌外緣內(nèi)氣管面積－平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積）／支氣管基底膜周徑。

1.5 BALF、血清中UⅡ含量及肺組織UⅡmRNA的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大鼠BALF及血清中UⅡ含量，所有標(biāo)本按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。使用酶標(biāo)儀在450 n m處測(cè)量吸光度（absor bance，A）。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription－poly merase chain reaction，RT－PCR）半定量檢測(cè)肺組織UⅡmRNA的表達(dá)。剪去凍存肺組織100 mg，按照 RNAiso Pl us試劑說(shuō)明書(shū)操作，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成c DNA，然后進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參。UⅡ上游引物：5′－TGCTGAGTACGTGGAGAT－3′；下游引物：5′－GTCTTCTGAGTGGCAGTG－3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度288 bp；GAPDH 上游引物：5′－ACGGACACTGGTGAAATG－3′；下游引物：5′－GAGTCTCGGCACTGGGAT－3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度136 bp。取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行掃描，分析測(cè)定每一個(gè)目的基因及GAPDH的A450nm值，以其A450nm比值表示基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)哮喘大鼠支氣管壁厚度及平滑肌厚度的影響

圖1 HE染色結(jié)果及定量結(jié)果（表1）顯示，與正常對(duì)照組相比（圖1 A），哮喘模型組支氣管壁厚度及平滑肌厚度均明顯升高（圖1 B）（P＜0.01）；經(jīng)姜黃素干預(yù)后，支氣管壁厚度及平滑肌厚度均明顯低于哮喘模型組（圖1C，D，E）（P＜0.01），但與正常對(duì)照組相比仍有升高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明姜黃素干預(yù)后，可以減緩支氣管壁的增加及平滑肌厚度的增加，但不能完全逆轉(zhuǎn)其發(fā)生。

Fig.1 Effect of curcu min on bronchial wall thickness and smooth muscle thickness in lung tissue of asthmatic rats（HE×200）.The rats in ast h ma model gr oup and curcu min gr oup were sensitized with intraperitoneal injection of 1 mg OVA with 100 mg alu minu m hydr oxide dissolved in 1.5 ml saline on day 1 and day 8.They were then challenged with 1%OVA aerosol every other day f or 30 min fr o m day 15 for 6 weeks.Curcu min 50，100 and 200 mg·kg－1 was ig given 30 min bef ore challenge fr o m day 15 f or 6 weeks，respectively.A：nor mal contr ol group；B：ast h ma model gr oup；C，D，E：model＋curcu min 50，100 and 200 mg·kg－1 gr oups，respectively.Arrows show t hickened br onchial s moot h muscle and bronchial wall.

Tab.1 Effect of curcumin on bronchial wall thickness and smooth muscle thickness in lung tissue of asthmatic rats

2.2 姜黃素對(duì)哮喘大鼠BALF及血清中UⅡ蛋白含量的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，哮喘模型組BALF和血清中UⅡ含量均明顯升高（P＜0.01）；不同劑量姜黃素組UⅡ含量與哮喘模型組相比均明顯降低（P＜0.01），而與正常對(duì)照組相比仍有升高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of curcumin on UⅡprotein expression in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）and ser um

2.3 姜黃素對(duì)哮喘大鼠肺組織中UⅡmRNA的影響

表3與圖2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組UⅡmRNA含量明顯增加（P＜0.01）；姜黃素干預(yù)后，UⅡmRNA含量較哮喘模型組明顯減少（P＜0.01）。各組大鼠肺組織中UⅡmRNA的含量與姜黃素劑量存在負(fù)相關(guān)（r＝－0.817，P＜0.01）。

Tab.3 Effect of curcumin on UⅡmRNA expression in lung tissue of asth matic rats

Fig.2 Effect of curcumin on UⅡmRNA expression in lung tissue of rats by RT－PCR.See Fig.1 f or the legend.Lane 1：normal contr ol group；lane 2：ast h ma model group；lanes 3－5：model＋curcu min 50，100 and 200 mg·kg－1 groups，respectively.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者肺組織中UⅡ表達(dá)明顯高于對(duì)照組，UⅡ可能通過(guò)促進(jìn)支氣管平滑肌收縮作用參與哮喘的發(fā)?。?］。人UⅡ在氣道中具有收縮活性［8］，同時(shí)UⅡ作為氣道平滑肌細(xì)胞的強(qiáng)絲裂原［9］，呈濃度依賴性地誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞增殖，其在哮喘患者血漿濃度長(zhǎng)時(shí)間維持在較高的水平，與哮喘患者氣道重塑密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，姜黃素不同劑量組大鼠的BALF和血清中UⅡ含量及肺組織UⅡmRNA的表達(dá)均明顯低于哮喘組，且其降低UⅡ含量及表達(dá)的程度具有一定的量效關(guān)系。組織病理觀察顯示，哮喘組大鼠支氣管壁厚度及平滑肌厚度增加明顯，低劑量姜黃素即引起哮喘大鼠支氣管壁厚度及平滑肌厚度降低，且其降低程度與姜黃素濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，與大鼠BALF和血清中UⅡ含量及肺組織UⅡmRNA各劑量組變化基本一致。說(shuō)明姜黃素抑制哮喘大鼠氣道重塑的作用與調(diào)控UⅡ的表達(dá)變化有關(guān)。因此，對(duì)姜黃素的進(jìn)一步研究有助于了解其在哮喘大鼠氣道重塑方面的作用及機(jī)制。

還有研究顯示，姜黃素對(duì)哮喘的防治作用尚與其抗炎效應(yīng)有關(guān)。姜黃素能抑制大鼠多形核中性粒細(xì)胞白三烯的形成，減輕炎性細(xì)胞前炎癥因子等作用［10］。當(dāng)然，姜黃素對(duì)哮喘氣道重塑的的抑制作用及機(jī)制復(fù)雜，還有待進(jìn)一步研究。

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