許波，楊云娟，李俊俊，唐湘華，慕躍林，黃遵錫

1 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500

2 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500

3 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

4 云南師范大學(xué)酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

人和動(dòng)物胃腸道內(nèi)存在大量微生物，它們與宿主的生理功能密切相關(guān)，這些微生物群落之間及微生物與動(dòng)物宿主之間形成了相互依存、相互作用的不可分割的整體。正常狀態(tài)下菌群和宿主之間相互交換能量物質(zhì)、傳遞信息，對(duì)宿主有營養(yǎng)、免疫、刺激生長和生物頡頏等作用，在胃腸道系統(tǒng)中起重要作用[1]。胃腸道中的內(nèi)源性微生物類群在種類、數(shù)量和定位等方面保持相對(duì)穩(wěn)定，形成了胃腸道的微生態(tài)平衡，是人和動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境中不可缺少的組成部分。最近由我國科學(xué)家參與完成的人體腸道宏基因組研究計(jì)劃 (European Metagenomics of the Human Intestinal Tract，MetaHIT)證明，人體腸道細(xì)菌群約有 300萬個(gè)基因，是人體基因數(shù)量的約150倍[2]。這對(duì)詮釋腸道細(xì)菌和人體健康的關(guān)系，研究腸道細(xì)菌在疾病發(fā)生中的作用，監(jiān)控、預(yù)防、干預(yù)腸道細(xì)菌，開發(fā)新藥都具有重要意義。因此，一個(gè)研究人體及動(dòng)物胃腸道微生物的高潮正在興起，本文旨在闡述宏基因組學(xué)在人和動(dòng)物胃腸道微生物研究中的應(yīng)用，同時(shí)著重介紹宏基因組研究的生物信息學(xué)技術(shù)。

1 宏基因組學(xué)簡介

“Metagenome”最早是1998年由Handelsman等[3]提出的，其定義為“the collective genomes of soil microflora”，即生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，既包含了可培養(yǎng)的又包含了未可培養(yǎng)的微生物基因，可翻譯為宏基因組、元基因組或環(huán)境基因組等。在宏基因組學(xué)研究中，借助于大規(guī)模測序，結(jié)合生物信息學(xué)工具，能夠發(fā)現(xiàn)大量過去無法獲得的未知微生物新基因或新的基因簇，這對(duì)了解復(fù)雜環(huán)境中的微生物群落組成及其代謝功能，挖掘具有應(yīng)用潛力的新基因具有重要意義。宏基因組學(xué)的研究通常有以下3種策略 (圖1)：1)利用引物PCR擴(kuò)增16S rDNA (特別是V6區(qū))或其他遺傳標(biāo)記，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測序；2)構(gòu)建宏基因組文庫；3)直接進(jìn)行Shotgun測序。

圖1 宏基因組學(xué)的研究策略示意圖Fig. 1 Possible steps in a metagenomic workflow.

2 宏基因組研究的生物信息學(xué)技術(shù)和平臺(tái)

宏基因組學(xué)技術(shù)的興起有效地解決了傳統(tǒng)微生物學(xué)在檢測和鑒定微生物物種方面的局限性，然而宏基因組學(xué)在發(fā)展過程中也遇到了與基因組學(xué)研究類似的瓶頸, 即如何高效分析宏基因組測序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)，因此相關(guān)的生物信息學(xué)分析方法和平臺(tái)就成為宏基因組學(xué)研究的重要手段。近年來，很多與宏基因組研究有關(guān) (如數(shù)據(jù)的組裝、基因預(yù)測、功能注釋等)的計(jì)算系統(tǒng)和軟件平臺(tái)不斷被開發(fā)，并被用于環(huán)境樣品微生物宏基因組的物種分類和功能組成研究。

2.1 宏基因組組裝

由于新一代測序技術(shù)的讀長較短 (幾十至幾百個(gè)堿基對(duì))，只能覆蓋基因的一部分，為此要將這些讀段組裝成較長的序列, 以重建全長基因，便于后續(xù)的分析處理。宏基因組組裝即把 reads拼裝成 contigs, 再由 contigs拼裝成scaffolds，常用的軟件見表1。主要可以分為兩類：1)基于 overlap graph的拼接軟件，包括Celera Assembler、ARACHNE、PCAP 等。2)基于de bruijn graph的拼接軟件，包括SOAPdenovo、Velvet、ALLPATHS、ABySS、MOCAT 等。

在有足夠高覆蓋率的宏基因組測序中，通過序列組裝有時(shí)可以重建群落中微生物的完整基因組[4-5]。然而 DNA保守區(qū)域的存在、微生物的變異和基因的水平轉(zhuǎn)移，實(shí)際上會(huì)導(dǎo)致許多高度復(fù)雜的群落中出現(xiàn)嵌合體以及 scaffolds重建時(shí)產(chǎn)生歧義[6-7]。盡管存在這些理論上的局限，Qin 等[2]以及 The Human Microbiome Project Consortium[8]利用單基因組裝配方法 (如SOAPdenovo)，在從宏基因組中重建高豐度微生物群落時(shí)已取得了不錯(cuò)的效果。然而，近年來通過從群落中存在歧義的序列中剔除嵌合序列，研究者開發(fā)出了一些專門針對(duì)宏基因組的裝配軟件，例如 MetaVelvet、khmer、Meta-AMOS和Meta-IDBA等。這些軟件采用基于圖形的重建方法，有效解決了多重基因組中保守序列所引起的基因組拷貝數(shù)變化及組裝時(shí)歧義序列的產(chǎn)生，因此被認(rèn)為是研究復(fù)雜生態(tài)群落微生物組的有力工具。

表1 宏基因組數(shù)據(jù)組裝常用軟件Table 1 Common software for metagenome assembly

2.2 基因預(yù)測

可用于宏基因組的基因預(yù)測軟件如表 2所示，由于采用了適合短reads的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，因此能檢測到不完整的ORFs，使得這些軟件對(duì)基因的預(yù)測比傳統(tǒng)基因預(yù)測方法更為靈敏和精確。然而宏基因組是由來自不同微生物的混合序列組成，不論用哪種方法對(duì)微生物宏基因組測序的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因預(yù)測，質(zhì)量都不及對(duì)基因組測序數(shù)據(jù)的預(yù)測。為了彌補(bǔ)這些缺陷、優(yōu)化預(yù)測結(jié)果，將幾種基因預(yù)測方法合并起來使用是常用的策略[26]。

2.3 物種分類鑒定

將獲得的序列及其基因功能分配至生境中特定微生物類群是當(dāng)前宏基因組學(xué)研究的重要問題之一，然而群落內(nèi)不同的物種豐度、復(fù)雜性，以及新物種的發(fā)現(xiàn)，使得對(duì)短讀長的DNA序列進(jìn)行物種分類極具挑戰(zhàn)性。目前，研究者已開發(fā)出多種用于宏基因組物種分類鑒定的軟件和工具 (表 3)，總體說來可以分為兩類[27]：1) 以序列內(nèi)在特性為基礎(chǔ)的分級(jí)方法(Intrinsic binning approaches)：通常從參照基因組中選擇系統(tǒng)發(fā)育分類器 (如 GC含量、k-mer頻率等)，然后利用統(tǒng)計(jì)學(xué)模型如Support Vector Machines with structured output (PhyloPythiaS)、interpolated Markov models (Phymm)、naive

Bayesian classifiers (NBC)、Self Organizing Maps(TaxSOM)等對(duì)宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分級(jí)；2)以序列外部信息或同源性為基礎(chǔ)的分類方法(Extrinsic or homology-based classification)：該方法是將宏基因組序列與從參照基因組中提取的最為有效的特征標(biāo)記 (如16S rRNA基因)直接進(jìn)行比較，此外，將其他一些保守性高的基因納入到這些通用標(biāo)記物中，可進(jìn)一步提高分類的普遍性和系統(tǒng)發(fā)育分辨率，例如AMPHORA[51]采用了31個(gè)標(biāo)記物，其中主要是核糖體蛋白。此外，有的工具則是將這兩種方法整合起來，如PhymmBL[43]、RITA[44]。

表2 宏基因組基因預(yù)測常用軟件Table 2 Common software for gene prediction

表3 宏基因組物種分類鑒定常用工具Table 3 Common tools for taxonomic classification

2.4 功能注釋

宏基因組的分析涉及通過與數(shù)據(jù)庫比對(duì)來對(duì)預(yù)測的基因進(jìn)行功能注釋，例如對(duì)SwissProt、NCBI nr、KEGG或 COGs數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì) Blast比對(duì)，對(duì) Pfam和 TIGRfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行HMMer比對(duì)，或是針對(duì)一些具有特殊功能的數(shù)據(jù)庫，如碳水化合物活性酶類數(shù)據(jù)庫CAZy進(jìn)行比對(duì)，注釋的結(jié)果可以作為后續(xù)代謝重構(gòu)等功能數(shù)據(jù)挖掘的基礎(chǔ)。目前，一些專用的宏基因組注釋平臺(tái)和系統(tǒng)已經(jīng)形成(表 4)，例如 MG-RAST、IMG/M 和 WebMGA，這些平臺(tái)不僅僅是單純的注釋系統(tǒng)，還陸續(xù)增加了一些如生物多樣性分析、分類鑒定和宏基因組比較等功能。隨后，一些專門針對(duì)宏基因組的比較工具也得到了開發(fā)，包括RAMMCAP、STAMP、METAREP、CoMet和METAGENassist。

表4 宏基因組基因功能注釋常用工具Table 4 Common tools for metagenomic functional annotation

3 宏基因組學(xué)在動(dòng)物胃腸道微生物研究中的應(yīng)用

3.1 動(dòng)物胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

地球上存在超過 55個(gè)細(xì)菌門類，但只有Bacteroidetes和Firmicutes這兩個(gè)深層進(jìn)化門類的菌群在胃腸道中占優(yōu)勢，這表明動(dòng)物胃腸道是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的環(huán)境，其微生物組成與其他生態(tài)環(huán)境有明顯差別。

宏基因組研究表明，人類的胃腸道微生物組比人類的基因組顯著富集與多糖、氨基酸和外源性化學(xué)物質(zhì)代謝有關(guān)的基因[62]，因此，胃腸道微生物組具有動(dòng)物宿主不需要獨(dú)立進(jìn)化、而又能幫助宿主從食物中獲取營養(yǎng)的基因，否則宿主就很難消化食物。同樣，雖然大熊貓以富含纖維素的竹子為食，但其基因組中卻缺乏消化纖維素的相關(guān)酶類基因，Zhu等通過分析大熊貓腸道微生物宏基因組，發(fā)現(xiàn)了包括纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等在內(nèi)的多種糖苷水解酶編碼基因[63]。這些研究更進(jìn)一步證實(shí)了胃腸道微生物與其宿主之間的共同進(jìn)化，不同的宿主，由于飲食、遺傳、環(huán)境和疾病等的影響都會(huì)在其進(jìn)化過程中形成與自身協(xié)調(diào)發(fā)展的腸道微生物組，并具有編碼相應(yīng)酶類的基因，以適應(yīng)宿主的生活狀態(tài)。因此，在利用宏基因組技術(shù)對(duì)人類胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行了大量系統(tǒng)的研究后[62-64]，研究者開始關(guān)注與人類生活關(guān)系密切的動(dòng)物，如雞[65]、狗[66]、豬[67]和貓[68]，以及牛[69-70]、鹿[71]和駱駝[72]等食草性動(dòng)物的胃腸道微生物。

2011年，Swanson等對(duì)狗糞便微生物的宏基因組進(jìn)行隨機(jī)測序[66]，分析發(fā)現(xiàn)Bacteroidetes/ Chlorobi group和Firmicutes是優(yōu)勢菌群，分別占所分析序列的約 35%，其次是Proteobacteria (13%～15%)和Fusobacteria (7%～8%)，與其他動(dòng)物胃腸道微生物宏基因組的層次聚類表明，狗與人類、鼠在系統(tǒng)分類和功能代謝上都最為相似。對(duì)豬糞便微生物宏基因組進(jìn)行shotgun測序的研究表明[67]，豬糞便微生物中占主導(dǎo)地位的是Firmicutes和Bacteroidetes，其中Prevotella spp.占優(yōu)勢，與其他動(dòng)物宏基因組數(shù)據(jù)的比較發(fā)現(xiàn)，豬糞便菌群的門類分布與牛瘤胃和雞盲腸最為相似。瘤胃中具有與纖維素降解密切相關(guān)的微生物群落，結(jié)合16S rRNA基因V3-V5區(qū)的擴(kuò)增子測序及宏基因組隨機(jī)測序研究表明[70]，出生 42 d牛犢的瘤胃菌群中Bacteroidetes占優(yōu)勢 (74.8%)，其次是Firmicutes(12.0%)、Proteobacteria (10.4%)、Verrucomicrobia(1.2%)和Synergistetes (1.1%)。而對(duì)駱駝瘤胃微生物宏基因組的比較分析也表明[72]，由于駱駝與牛具有相似的消化道結(jié)構(gòu)和功能，其瘤胃微生物群落的結(jié)構(gòu)組成和功能都最為相似。

由于非人靈長類動(dòng)物在進(jìn)化上與人類關(guān)系較近，本實(shí)驗(yàn)室以一種低等靈長類動(dòng)物倭蜂猴為研究對(duì)象，利用宏基因組隨機(jī)測序?qū)ζ浼S便微生物的結(jié)構(gòu)組成及其潛在功能進(jìn)行了全面研究。物種組成分析表明，與人類相似，倭蜂猴糞便微生物組中Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria和 Firmicutes占優(yōu)勢，然而其所占相對(duì)比例卻不同。在人類所占比例較小的Proteobacteria 和 Actinobacteria在倭蜂猴中更為普遍，而所占比例較大的Firmicutes在倭蜂猴中所占的比例卻較小。同時(shí)，通過對(duì)倭蜂猴與人及其他一些動(dòng)物的胃腸道宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行雙向聚類發(fā)現(xiàn)，雖然倭蜂猴和小鼠腸道系統(tǒng)的功能有差異，但其微生物群落結(jié)構(gòu)卻最為相似[73]。

3.2 篩選功能活性物質(zhì)

動(dòng)物胃腸道中棲息著大量的微生物，能分泌纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶和酯酶等水解酶，在動(dòng)物消化過程中起著積極的不可忽視的作用。然而，由于胃腸道微生物大都是專性厭氧菌，可培養(yǎng)性很低，因此傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)僅能分離獲得胃腸道中約 15%～20%的微生物[70,74]，即使在最近的研究中利用全面的厭氧培養(yǎng)和高通量16S測序技術(shù)，也只有56%的胃腸道微生物得以培養(yǎng)[75]。因此，還有近一半的胃腸道微生物因?yàn)闊o法培養(yǎng)而難以鑒定，同時(shí)，這也大大限制了通過分離培養(yǎng)微生物來發(fā)現(xiàn)和篩選新基因及生物活性物質(zhì)的廣泛性和有效性。

宏基因組學(xué)避開了微生物分離培養(yǎng)的問題，極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用空間，為尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能基因及生物催化劑提供了新的研究策略。目前，國內(nèi)外研究者已通過構(gòu)建動(dòng)物胃腸道微生物宏基因組文庫或?qū)昊蚪M進(jìn)行直接測序，成功篩選到多種糖苷水解酶及淀粉酶、脂酶/酯酶等酶類基因 (表5)。由于植食性動(dòng)物胃腸道是一個(gè)植物纖維素劇烈降解的環(huán)境，存在其中的微生物具備了相應(yīng)的特殊生理、代謝特點(diǎn)，能產(chǎn)生各種纖維素分解酶類，因此，近年來利用宏基因組學(xué)技術(shù)從動(dòng)物胃腸道篩選酶基因的研究主要集中在植食性動(dòng)物。對(duì)白蟻[80]、牛[86,90]、袋鼠[87]和大熊貓[63]胃腸道微生物宏基因組的研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物胃腸道中含有種類和數(shù)量豐富的植物生物質(zhì)降解酶類。Hess等[90]通過分析牛瘤胃 2 791個(gè)經(jīng)證實(shí)具有生物質(zhì)降解酶功能的基因同源性發(fā)現(xiàn)，只有1%與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的基因有較高的相似性。此外，不同植食性動(dòng)物由于攝食種類不同，其胃腸道內(nèi)的植物生物質(zhì)降解酶種類也存在很大差異。Warnecke等[80]通過對(duì)白蟻腸道微生物宏基因組的研究發(fā)現(xiàn)，其木質(zhì)纖維素的降解以 GH5、GH94、GH51、GH8、GH9、GH44、GH45 和GH74的纖維素酶為主，然而卻缺乏多數(shù)微生物纖維素酶系中的重要組成成分GH6和 GH48。上述研究表明，植食性動(dòng)物胃腸道內(nèi)蘊(yùn)涵著大量潛在的纖維素分解酶類基因資源，為新型纖維素分解酶類的研究開發(fā)及其在生物能源領(lǐng)域的應(yīng)用提供了豐富的資源。

表5 從人和動(dòng)物胃腸道宏基因組中篩選到的酶類Table 5 Identified enzymes from metagenome of animal gastrointestinal tract

本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)低等靈長類動(dòng)物倭蜂猴進(jìn)行研究時(shí)，構(gòu)建了Fosmid宏基因組文庫，并利用功能篩選法從50 000個(gè)克隆中篩選到8個(gè)產(chǎn)淀粉酶的陽性克隆，通過亞克隆獲得一個(gè)新的淀粉酶基因，并對(duì)其進(jìn)行了生化鑒定(結(jié)果待發(fā)表)，從而也證實(shí)了利用功能篩選從胃腸道微生物宏基因組中發(fā)現(xiàn)和篩選新基因及生物活性物質(zhì)的可行性。

3.3 研究胃腸道微生物與人類健康和疾病的關(guān)系

人體含有的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量是人細(xì)胞的10倍多，其中大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞位于人腸道中，這些腸道菌群如何影響我們的健康？最近的宏基因組學(xué)研究表明，胃腸道微生物組的異常與人類的多種疾病過程有關(guān)聯(lián)。

3.3.1 胃腸道微生物與肥胖

全球范圍的肥胖問題促使研究者更加努力地尋找影響能量平衡的環(huán)境因素和人類自身因素，宏基因組為腸道微生物在肥胖形成中所起的作用提供了重要證據(jù)。Ley等[99]的研究發(fā)現(xiàn)，肥胖老鼠與同窩出生的瘦老鼠相比，盲腸內(nèi)容物中Bacteroidetes和Firmicutes的比例發(fā)生明顯變化。然而這一結(jié)果并不能證明是Bacteroidetes菌群的變化導(dǎo)致了體重的增加，還是由于特殊的飲食攝入所致。然而，Turnbaugh等通過宏基因組和生化分析所進(jìn)行的研究證實(shí)[100]，Bacteroidetes和Firmicutes細(xì)菌相對(duì)豐度的變化影響著腸道微生物的代謝能力，肥胖小鼠的腸道微生物具有更高的從飲食中攝取能量的能力；與定植有“瘦型微生物組”的小鼠相比，“肥胖型微生物組”可以促使小鼠體重的增加，從而說明肥胖這一表型可以通過微生物組傳遞。

為闡明宿主基因型、環(huán)境暴露以及肥胖對(duì)腸道微生物的影響，Turnbaugh等[101]利用宏基因組學(xué)技術(shù)，對(duì) 154個(gè)肥胖或瘦表型一致的同卵雙生和異卵雙生成年女性及其母親的糞便微生物群落進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與瘦者相比肥胖者體內(nèi)擬桿菌門細(xì)菌比例降低，而放線菌門細(xì)菌比例升高；肥胖者腸道微生物多樣性降低，助長了異常的能量輸入，并且微生物處理碳水化合物的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)較瘦型志愿者更為富集?？梢姡⑸锝M成在門水平上的變化、細(xì)菌多樣性的降低以及代謝途徑改變均與肥胖相關(guān)。

3.3.2 胃腸道微生物與糖尿病

肥胖是Ⅱ型糖尿病發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一，最近研究者開始推測腸道菌群除影響肥胖外，可能對(duì)糖尿病也會(huì)產(chǎn)生影響。Qin等研究了來自中國的 345人的腸道細(xì)菌宏基因組，其中171人患有Ⅱ型糖尿病，結(jié)果表明人體內(nèi)腸道細(xì)菌的組成在Ⅱ型糖尿病的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[102]。此外，Brown等通過分析4例自體免疫I型糖尿病個(gè)案的糞便微生物宏基因組文庫，認(rèn)為自體免疫性疾病包括 I型糖尿病的產(chǎn)生與體內(nèi)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)有關(guān)[103]。

3.3.3 胃腸道微生物與炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)

Manichanh等[104]通過構(gòu)建宏基因組文庫對(duì)6個(gè)健康人和6個(gè)CD (Crohn’s disease)患者的糞便微生物組進(jìn)行了研究。在所篩選的1 190個(gè)克隆中，鑒定出 125個(gè)非冗余核糖體基因型，主要為擬桿菌門和厚壁菌門。其中，在健康人體腸道中鑒定出 43種厚壁菌門細(xì)菌，而在CD患者中僅鑒定出 13種，尤其是柔嫩梭菌在CD患者中的比例顯著低于正常人，可見，細(xì)菌組成多樣性的降低是CD患者糞便微生物的特征。

作為MetaHIT計(jì)劃的一部分，2010年，Qin等[2]比較分析了 IBD患者與健康人的糞便微生物宏基因組，發(fā)現(xiàn)IBD患者比健康人的腸道菌群總基因平均少25%，這一研究同樣顯示IBD患者與健康人相比具有較低的細(xì)菌多樣性。

3.3.4 胃腸道微生物與其他疾病

Chen等[105]通過對(duì)16S rRNA V3區(qū)擴(kuò)增子進(jìn)行焦磷酸測序，分析了36個(gè)肝硬化病人和24個(gè)正常人腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，門水平上肝硬化患者腸道中擬桿菌門細(xì)菌的比例顯著降低，變形菌門和梭桿菌門細(xì)菌顯著富集，科水平上肝硬化患者腸道中則顯著富集腸桿菌科、韋榮球菌科和鏈球菌科的細(xì)菌。

此外，最新的研究還證實(shí)人腸道菌群變化與表現(xiàn)出癥狀的動(dòng)脈粥樣硬化和中風(fēng)相關(guān)聯(lián)，Karlsson等[106]對(duì)中風(fēng)病人和健康人腸道微生物的宏基因組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，其腸道菌群存在明顯差異，且病人的宏基因組中富含編碼肽聚糖生物合成的基因，而健康對(duì)照組中富含編碼八氫番茄紅素脫氫酶的基因。

4 展望

宏基因組學(xué)的應(yīng)用大大拓寬了人和動(dòng)物胃腸道微生物的研究內(nèi)容和范圍，使單純的微生物群落結(jié)構(gòu)研究逐步過渡到功能代謝研究。然而，要想深入了解胃腸道生態(tài)系統(tǒng)中特定微生物的實(shí)際地位或作用，實(shí)現(xiàn)腸道菌群與宿主間的“交談”，鑒定微生物在胃腸道生態(tài)環(huán)境中生存所需基因，研究胃腸道微生物和宿主免疫系統(tǒng)之間的互作機(jī)制及胃腸道菌群調(diào)節(jié)宿主多種表型的機(jī)制至關(guān)重要。胃腸道微生物的組成對(duì)哺乳動(dòng)物功能基因組及其健康和疾病的研究具有重要影響，因此，進(jìn)一步深入了解人類及其他動(dòng)物胃腸道微生物群落的組成和功能，對(duì)于監(jiān)控、預(yù)防、干預(yù)腸道菌群，探索胃腸道疾病和其他系統(tǒng)性疾病的治療方法，以及促進(jìn)胃腸道微生物資源的開發(fā)和利用將具有重要意義。

[1]Nicholson JK, Holmes E, Wilson ID. Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care. Nat Rev Microbiol, 2005,3(5): 431?438.

[2]Qin J, Li R, Raes J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature, 2010, 464(7285): 59?65.

[3]Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, et al.Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chem Biol, 1998, 5(10): 245?249.

[4]Culley AI, Lang AS, Suttle CA. Metagenomic analysis of coastal RNA virus communities. Science,2006, 312(5781): 1795–1798.

[5]Narasingarao P, Podell S, Ugalde JA, et al. De novo metagenomic assembly reveals abundant novel major lineage of Archaea in hypersaline microbial communities. ISME J, 2012, 6(1): 81–93.

[6]Pignatelli M, Moya A. Evaluating the fidelity of de novo short read metagenomic assembly using simulated data. PLoS ONE, 2011, 6(5): e19984.

[7]Mende DR, Waller AS, Sunagawa S, et al.Assessment of metagenomic assembly using simulated next generation sequencing data. PLoS ONE, 2012, 7(2): e31386.

[8]The Human Microbiome Project Consortium. A framework for human microbiome research. Nature,2012, 486(7402): 215–221.

[9]Batzoglou S, Jaffe D, Stanley K, et al. ARACHNE:A whole-genome shotgun assembler. Genome Res,2002, 12(1): 177?189.

[10]Huang X, Wang J, Aluru S, et al. PCAP: a whole-genome assembly program. Genome Res,2003, 13(9): 2164?2170.

[11]Miller JR, Delcher AL, Koren S, et al. Aggressive assembly of pyrosequencing reads with mates.Bioinfomaticts, 2008, 24(24): 2818?2824.

[12]Lai B, Ding R, Li Y, et al. A de novo metagenomic assembly program for shotgun DNA reads.Bioinformatics, 2012, 28(11): 1455?1462.

[13]Warren RL, Sutton GG, Jones SJ, et al. Assembling millions of short DNA sequences using SSAKE.Bioinformatics, 2007, 23(4): 500?501.

[14]Zerbino DR, Birney E. Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs.Genome Res, 2008, 18(5): 821?829.

[15]Butler J, MacCallum I, Kleber M, et al. ALLPATHS:de novo assembly of whole-genome shotgun microreads. Genome Res, 2008, 18(5): 810?820.

[16]Simpson JT, Wong K, Jackman SD, et al. ABySS: a parallel assembler for short read sequence data.Genome Res, 2009, 19(6): 1117?1123.

[17]Boisvert S, Laviolette F, Corbeil J. Ray:simultaneous assembly of reads from a mix of high-throughput sequencing technologies. J Comput Biol, 2010, 17(11): 1519?1533.

[18]Li R, Zhu H, Ruan J, et al. De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing. Genome Res, 2010, 20(2): 265?272.

[19]Laserson J, Jojic V, Koller D. Genovo: de novo assembly for metagenomes. J Comput Biol, 2011,18(3): 429?443.

[20]Treangen TJ, Sommer DD, Angly FE, et al. Next generation sequence assembly with AMOS. Curr Protoc Bioinformatics, 2011, 33: 11.8.1–11.8.18.

[21]Peng Y, Leung HC, Yiu SM, et al. Meta-IDBA: a de novo assembler for metagenomic data.Bioinformatics, 2011, 27(13): i94?101.

[22]Namiki T, Hachiya T, Tanaka H, et al. MetaVelvet:an extension of Velvet assembler to de novo metagenome assembly from short sequence reads.Nucleic Acids Res, 2012, 40(20): e155.

[23]Pell J, Hintze A, Canino-Koning R, et al. Scaling metagenome sequence assembly with probabilistic de Bruijn graphs. Proc Natl Acad Sci USA, 2012,109(33): 13272–13277.

[24]Peng Y, Leung HC, Yiu SM, et al. IDBA-UD: a de novo assembler for single-cell and metagenomic sequencing data with highly uneven depth.Bioinformatics, 2012, 28(11): 1420?1428.

[25]Kultima JR, Sunagawa S, Li J, et al. MOCAT: a metagenomics assembly and gene prediction toolkit.PLoS ONE, 2012, 7(10): e47656.

[26]Yok NG, Rosen GL. Combining gene prediction methods to improve metagenomic gene annotation.BMC Bioinformatics, 2011, 12: 20.

[27]Segata N, Boernigen D, Tickle TL, et al.Computational meta'omics for microbial community studies. Mol Syst Biol, 2013, 9: 666.

[28]Noguchi H, Park J, Takagi T. MetaGene: prokaryotic gene finding from environmental genome shotgun sequences. Nucleic Acids Res, 2006, 34(19):5623?5630.

[29]Noguchi H, Taniguchi T, Itoh T.MetaGeneAnnotator: detecting species-specific patterns of ribosomal binding site for precise gene prediction in anonymous prokaryotic and phage genomes. DNA Res, 2008, 15(6): 387?396.

[30]Hoff KJ, Lingner T, Meinicke P, et al. Orphelia:predicting genes in metagenomic sequencing reads.Nucleic Acids Res, 2009, 37:W101?105.

[31]Zhu W, Lomsadze A, Borodovsky M. Ab initio gene identification in metagenomic sequences. Nucleic Acids Res, 2010, 38(12): e132.

[32]Rho M, Tang H, Ye Y. FragGeneScan: predicting genes in short and error-prone reads. Nucleic Acids Res, 2010, 38(20): e191.

[33]Kelley DR, Liu B, Delcher AL, et al. Gene prediction with Glimmer for metagenomic sequences augmented by classification and clustering. Nucleic Acids Res, 2012, 40(1): e9.

[34]DeSantis TZ, Hugenholtz P, Larsen N, et al.Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(7): 5069?5072.

[35]Wang Q, Garrity GM, Tiedje JM, et al. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(16): 5261?5267.

[36]Monzoorul Haque M, Ghosh TS, Komanduri D, et al.SOrt-ITEMS: sequence orthology based approach for improved taxonomic estimation of metagenomic sequences. Bioinformatics, 2009, 25(14):1722?1730.

[37]Schloss PD, Westcott SL, Ryabin T, et al.Introducing mothur: open-source,platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(23):7537?7541.

[38]Diaz NN, Krause L, Goesmann A, et al. TACOA:taxonomic classification of environmental genomic fragments using a kernelized nearest neighbor approach. BMC Bioinformatics, 2009, 10: 56.

[39]Schreiber F, Gumrich P, Daniel R, et al. Treephyler:fast taxonomic profiling of metagenomes.Bioinformatics, 2010, 26(7): 960?961.

[40]Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods, 2010,7(5): 335?336.

[41]Weber M, Teeling H, Huang S, et al. Practical application of self-organizing maps to interrelate biodiversity and functional data in NGS-based metagenomics. ISME J, 2010, 5(5): 918–928.

[42]Liu B, Gibbons T, Ghodsi M, et al. Accurate and fast estimation of taxonomic profiles from metagenomic shotgun sequences. BMC Genomics, 2011, 12(Suppl 2): S4.

[43]Brady A, Salzberg S. PhymmBL expanded:confidence scores, custom databases, parallelization and more. Nat Methods, 2011, 8(5): 367.

[44]Parks DH, MacDonald NJ, Beiko RG. Classifying short genomic fragments from novel lineages using composition and homology. BMC Bioinformatics,2011, 12: 328.

[45]Jia P, Xuan L, Liu L, et al. MetaBinG: using GPUs to accelerate metagenomic sequence classification.PLoS ONE, 2011, 6(11): e25353.

[46]Rosen GL, Reichenberger ER, Rosenfeld AM. NBC:the Naive bayes classification tool webserver for taxonomic classification of metagenomic reads.Bioinformatics, 2011, 27(1): 127?129.

[47]Gerlach W, Stoye J. Taxonomic classification of metagenomic shotgun sequences with CARMA3.Nucleic Acids Res, 2011, 39(14): e91.

[48]Huson DH, Mitra S, Ruscheweyh HJ, et al. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.Genome Res, 2011, 21(9): 1552?1560.

[49]Patil KR, Roune L, McHardy AC. The PhyloPythiaS web server for taxonomic assignment of metagenome sequences. PLoS ONE, 2012, 7(6): e38581.

[50]Su X, Xu J, Ning K. Parallel-META: efficient metagenomic data analysis based on high-performance computation. BMC Syst Biol,2012, 6(Suppl 1): S16.

[51]Wu M, Scott AJ. Phylogenomic analysis of bacterial and archaeal sequences with AMPHORA2.Bioinformatics, 2012, 28(7): 1033–1034.

[52]Kotera M, Hirakawa M, Tokimatsu T, et al. The KEGG databases and tools facilitating omics analysis: latest developments involving human diseases and pharmaceuticals. Methods Mol Biol,2012, 802: 19–39.

[53]Cantarel BL, Coutinho PM, Rancurel C, et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res, 2009, 37: D233?238.

[54]Meyer F, Paarmann D, D'Souza M, et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics, 2008, 9: 386.

[55]Markowitz VM, Chen IM, Chu K, et al. IMG/M: the integrated metagenome data management and comparative analysis system. Nucleic Acids Res,2012, 40: D123?129.

[56]Wu S, Zhu Z, Fu L, et al. WebMGA: a customizable web server for fast metagenomic sequence analysis.BMC Genomics, 2011, 12: 444.

[57]Li W. Analysis and comparison of very large metagenomes with fast clustering and functional annotation. BMC Bioinformatics, 2009, 10: 359.

[58]Parks DH, Beiko RG. Identifying biologically relevant differences between metagenomic communities. Bioinformatics, 2010, 26(6): 715?721.

[59]Goll J, Rusch DB, Tanenbaum DM, et al. METAREP:JCVI metagenomics reports--an open source tool for high-performance comparative metagenomics.Bioinformatics, 2010, 26(20): 2631?2632.

[60]Lingner T, Asshauer KP, Schreiber F, et al.CoMet--a web server for comparative functional profiling of metagenomes. Nucleic Acids Res, 2011,39: W518?523.

[61]Arndt D, Xia J, Liu Y, et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Res, 2012, 40:W88?95.

[62]Gill SR, Pop M, Deboy RT, et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science,2006, 312(5778): 1355–1359.

[63]Zhu L, Wu Q, Dai J, et al. Evidence of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108 (43): 17714?17719.

[64]Kurokawa K, Itoh T, Kuwahara T, et al. Comparative metagenomics revealed commonly enriched gene sets in human gut microbiomes. DNA Res, 2007,14(4): 169–181.

[65]Qu A, Brulc JM, Wilson MK, et al. Comparative metagenomics reveals host specific metavirulomes and horizontal gene transfer elements in the chicken cecum microbiome. PLoS ONE, 2008, 3(8): e2945.

[66]Swanson KS, Dowd SE, Suchodolski JS, et al.Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice. ISME J, 2011, 5(4): 639–649.

[67]Lamendella R, Domingo JW, Ghosh S, et al.Comparative fecal metagenomics unveils unique functional capacity of the swine gut. BMC Microbiol,2011, 11: 103.

[68]Tun HM, Brar MS, Khin N, et al. Gene-centric metagenomics analysis of feline intestinal microbiome using 454 junior pyrosequencing. J Microbiol Methods, 2012, 88(3): 369–376.

[69]Singh KM, Ahir VB, Tripathi AK, et al.Metagenomic analysis of Surti buffalo (Bubalus bubalis)rumen: a preliminary study. Mol Biol Rep,2012, 39(4): 4841?4848.

[70]Li RW, Connor EE, Li C, et al. Characterization of the rumen microbiota of pre-ruminant calves using metagenomic tools. Environ Microbiol, 2012, 14(1):129?139.

[71]Pope PB, Mackenzie AK, Gregor I, et al.Metagenomics of the Svalbard reindeer rumen microbiome reveals abundance of polysaccharide utilization loci. PLoS ONE, 2012, 7(6): e38571.

[72]Bhatt VD, Dande SS, Patil NV, et al. Molecular analysis of the bacterial microbiome in the forestomach fluid from the dromedary camel(Camelus dromedarius). Mol Biol Rep, 2013, 40(4):3363?3371.

[73]Xu B, Xu W, Yang F, et al. Metagenomic analysis of the pygmy loris fecal microbiome reveals unique functional capacity related to metabolism of aromatic compounds. PLoS ONE, 2013, 8(2): e56565.

[74]Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science,2005, 308(5728): 1635–1638.

[75]Goodman AL, Kallstrom G, Faith JJ, et al. Extensive personal human gut microbiota culture collections characterized and manipulated in gnotobiotic mice.Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(15): 6252–6257.

[76]Walter J, Mangold M, Tannock GW. Construction,analysis, and beta-glucanase screening of a bacterial artificial chromosome library from the large-bowel microbiota of mice. Appl Environ Microbiol, 2005,71(5): 2347?2354.

[77]Ferrer M, Golyshina OV, Chernikova TN, et al.Novel hydrolase diversity retrieved from a metagenome library of bovine rumen microflora.Environ Microbiol, 2005, 7(12): 1996?2010.

[78]Palackal N, Lyon CS, Zaidi S, et al. A multifunctional hybrid glycosyl hydrolase discovered in an uncultured microbial consortium from ruminant gut. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74(1):113?124.

[79]Feng Y, Duan CJ, Pang H, et al. Cloning and identification of novel cellulase genes from uncultured microorganisms in rabbit cecum and characterization of the expressed cellulases. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(2): 319?328.

[80]Warnecke F, Luginbuhl P, Ivanova N, et al.Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature,2007, 450(7169): 560?565.

[81]Guo H, Feng Y, Mo XC, et al. Cloning and expression of a β-glucosidase gene umcel3G from metagenome of buffalo rumen and characterization of the translated product. Chin J Biotech, 2008, 24(2):232?238 (in Chinese).郭鴻, 封毅, 莫新春, 等. 水牛瘤胃宏基因組的一個(gè)新的 β-葡萄糖苷酶基因 umcel3G的克隆、表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)特性. 生物工程學(xué)報(bào), 2008,24(2): 232?238.

[82]Wang F, Li F, Chen G, et al. Isolation and characterization of novel cellulase genes from uncultured microorganisms in different environmental niches. Microbiol Res, 2009, 164(6):650?657.

[83]Shedova EN, Berezina OV, Lunina NA, et al.Cloning and characterization of a large metagenomic DNA fragment containing glycosyl-hydrolase genes.Mol Gen Mikrobiol Virusol, 2009, 24(1): 11?15.

[84]Duan CJ, Xian L, Zhao GC, et al. Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens. J Appl Microbiol, 2009, 107(1): 245?256.

[85]Liu L, Feng Y, Duan CJ, et al. Isolation of a gene encoding endoglucanase activity from uncultured microorganisms in buffalo rumen. World J Microb Biot, 2009, 25(6): 1035?1042.

[86]Brulc JM, Antonopoulos DA, Miller ME, et al.Gene-centric metagenomics of the fiber-adherent bovine rumen microbiome reveals forage specific glycoside hydrolases. Proc Natl Acad Sci USA, 2009,106(6): 1948?1953.

[87]Pope P, Denman S, Jones M, et al. Adaptation to herbivory by the Tammar wallaby includes bacterial and glycoside hydrolase profiles different from other herbivores. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(33):14793?14798.

[88]Zhao S, Wang J, Bu D, et al. Novel glycoside hydrolases identified by screening a Chinese Holstein dairy cow rumen-derived metagenome library. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(19):6701–6705.

[89]Tasse L, Bercovici J, Pizzut-Serin S, et al.Functional metagenomics to mine the human gut microbiome for dietary fiber catabolic enzymes.Genome Res, 2010, 20(11): 1605–1612.

[90]Hess M, Sczyrba A, Egan R, et al. Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen. Science, 2011, 331(6016):463?467.

[91]Bao L, Huang Q, Chang L, et al. Cloning and characterization of two β-glucosidase/xylosidase enzymes from yak rumen metagenome. Appl Biochem Biotechnol, 2012, 166(1): 72?86.

[92]Ferrer M, Ghazi A, Beloqui A, et al. Functional metagenomics unveils a multifunctional glycosyl hydrolase from the family 43 catalysing the breakdown of plant polymers in the calf rumen.PLoS ONE, 2012, 7(6): e38134.

[93]Gong X, Gruninger RJ, Qi M, et al. Cloning and identification of novel hydrolase genes from a dairy cow rumen metagenomic library and characterization of a cellulase gene. BMC Res Notes, 2012, 5: 566.

[94]Nimchua T, Thongaram T, Uengwetwanit T, et al.Metagenomic analysis of novel lignocellulose-degrading enzymes from higher termite guts inhabiting microbes. J Microbiol Biotechnol, 2012, 22(4): 462?469.

[95]Rashamuse KJ, Visser DF, Hennessy F, et al.Characterisation of two bifunctional cellulase-xylanase enzymes isolated from a bovine rumen metagenome library. Curr Microbiol, 2013, 66(2): 145?151.

[96]Ferrer M, Beloqui A, Golyshina OV, et al.Biochemical and structural features of a novel cyclodextrinase from cow rumen metagenome.Biotechnol J, 2007, 2(2): 207–213.

[97]Lee CC, Kibblewhite RE, Wagschal K, et al.Isolation of α-glucuronidase enzyme from a rumen metagenomic library. Protein J, 2012, 31(3):206–211.

[98]Zhao SG, Wang JQ, Liu KL, et al. Screening and characterization of lipase from a metagenome library of dairy rumen microflora. Chin J Biotech, 2009,25(6): 869?874 (in Chinese).趙圣國, 王加啟, 劉開朗, 等. 奶牛瘤胃微生物元基因組文庫中脂肪酶的篩選與酶學(xué)性質(zhì). 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(6): 869?874.

[99]Ley RE, B?ckhed F, Turnbaugh P, et al. Obesity alters gut microbial ecology. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(31): 11070?11075.

[100]Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature, 2006, 444(7122):1027–1031.

[101]Turnbaugh PJ, Hamady M, Yatsunenko T, et al. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature,2009, 457(7228): 480–484.

[102]Qin J, Li Y, Cai Z, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes.Nature, 2012, 490(7418): 55?60.

[103]Brown CT, Davis-Richardson AG, Giongo A, et al.Gut microbiome metagenomics analysis suggests a functional model for the development of autoimmunity for type 1 diabetes. PLoS ONE, 2011,6(10): e25792.

[104]Manichanh C, Rigottier-Gois L, Bonnaud E, et al.Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach. Gut,2006, 55(2): 205–211.

[105]Chen Y, Yang F, Lu H, et al. Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis. Hepatology, 2011, 54(2): 562–572.

[106]Karlsson FH, F?k F, Nookaew I, et al. Symptomatic atherosclerosis is associated with an altered gut metagenome. Nat Commun, 2012, 3: 1245.