張楠，白銀，趙景壯，葉賢龍，王文飛，任桂萍，李德山，荊燕

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

隨著人們對疾病的發(fā)生機(jī)理了解日益深入，一大批具有治療價值的多肽類藥物陸續(xù)被人們發(fā)現(xiàn)并進(jìn)入市場，每年平均16.8%多肽類藥物進(jìn)入臨床研究[1]?？墒悄壳笆袌錾蠜]有一個多肽類藥物作用于胞內(nèi)蛋白，如此便限制了它們的治療空間。根據(jù)Lipinski五規(guī)則[2]，蛋白多肽類藥物沒有良好的滲透性，不能自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。目前所使用的多肽類藥物均只能作用于胞外及細(xì)胞表面，如此便有大量的靶點(diǎn)未能開發(fā)及利用[3]，而且皮下和靜脈給藥的方式又給病人的身體帶來了痛苦。

細(xì)胞穿膜肽又稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域、特洛伊肽，具有攜帶比起自身大100倍的物質(zhì)穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的能力。自 1988年首次被人們發(fā)現(xiàn)以來[4-5]，細(xì)胞穿膜肽已經(jīng)被應(yīng)用于多方面的研究及應(yīng)用。一小部分基于細(xì)胞穿膜肽研發(fā)的藥物已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，例如：AZX100 (Capstone Therapeutics)，RT001 (ReVance Therapeutics)，KAI-9803 (KAI Pharmaceuticals)，XG-102 (Auris Medical)。

多聚精氨酸作為目前已知最為簡單有效的細(xì)胞穿膜肽，其中以九聚精氨酸 (R9)效率最高(大約為TAT的20倍)[6-7]，具有極大的研究及應(yīng)用價值。為了便于純化 R9融合蛋白，我們在pSUMO載體基礎(chǔ)上構(gòu)建pSUMO-R9-EGFP原核蛋白表達(dá)載體。雖然R9具有很高的穿膜效率，但精氨酸作為一種極性很強(qiáng)的氨基酸，大量精氨酸的存在極易使重組蛋白過表達(dá)時形成包涵體，從而增加純化難度。SUMO廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白的核質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞周期等多種生理進(jìn)程[8]，SUMO作為一個分子伴侶可增加重組蛋白在大腸桿菌高效表達(dá)時的可溶性[9]，再經(jīng)SUMO酶1酶切后可得高度提純的目的蛋白，且不殘留額外的氨基酸[10]。為避免R9對EGFP的空間結(jié)構(gòu)造成影響，兩者經(jīng)一個15氨基酸的GS柔性連接肽 (Gly4Ser)3相間隔。本研究的目的是利用 SUMO表達(dá)和純化系統(tǒng)，高效、可溶性表達(dá)R9融合蛋白R9-EGFP，并檢驗(yàn)該融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞的能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞穿膜肽R9可快速有效地?cái)y帶EGFP進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，胞內(nèi)EGFP熒光強(qiáng)度呈時間、劑量依賴性，大約1.5 h以后熒光強(qiáng)度增加不顯著。這些數(shù)據(jù)顯示，我們可以利用SUMO-R9表達(dá)系統(tǒng)快速高效地表達(dá)R9融合蛋白，進(jìn)行蛋白和細(xì)胞間的瞬時相互作用。同時為臨床蛋白藥物研發(fā)和改進(jìn)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種大腸桿菌 Escherichia coli DH5α，Rosetta(DE3)用于質(zhì)粒擴(kuò)增及蛋白表達(dá)。表達(dá)質(zhì)粒 pSUMO及 pEE6.4-EGFP為本實(shí)驗(yàn)室保存，Ni-NTA樹脂購自Qiagen公司。引物由Invitrogen公司合成。

其中引物RF及RR變性復(fù)性后為R9序列兩端預(yù)留BsaⅠ及NheⅠ黏性末端；引物L(fēng)F及LR變性復(fù)性后為(Gly4Ser)3序列兩端預(yù)留 NheⅠ及BamHⅠ黏性末端；引物E1、E2、E3用于EGFP的克隆。

1.2 pSUMO-EGFP及pSUMO-R9-EGFP的構(gòu)建

以引物E3、E2克隆EGFP基因后，利用引物上的BsaⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)將片段制備出粘性末端。利用連接酶將基因插入相應(yīng)的 SUMO載體，獲得的重組載體命名為pSUMO-EGFP。

以引物E1、E2克隆EGFP基因后利用引物上的BamHⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)將片段制備出粘性末端。利用連接酶將基因插入相應(yīng)的 SUMO載體，再經(jīng)BsaⅠ、BamHⅠ酶切制備出粘性末端，插入R9及GS linker序列，重組載體經(jīng)測序鑒定正確后，將重組載體命名為pSUMO-R9-EGFP。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3 SUMO-EGFP及SUMO-R9-EGFP的蛋白表達(dá)

將構(gòu)建好的 pSUMO-EGFP及 pSUMO-R9-EGFP轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)。挑取單克隆于LB培養(yǎng)基 (氨芐青霉素100 mg/L)，37 ℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物以1∶100的比例接種至0.5 L上述抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4時，加入IPTG使其終濃度達(dá)0.25 mmol/L，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心收獲菌體。

1.4 SUMO-EGFP及SUMO-R9-EGFP可溶性的比較

收獲的菌體以緩沖液1 (50 mmol/L磷酸三鈉，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑)重懸，超聲破碎菌體后離心，分別取上清液和沉淀進(jìn)行 15% SDS-PAGE電泳分析。比較SUMO-EGFP融合蛋白和SUMO-R9-EGFP融合蛋白的可溶性表達(dá)。

1.5 SUMO-EGFP及SUMO-R9-EGFP蛋白的提取

收獲的菌體以緩沖液1重懸，進(jìn)行超聲破碎。4 ℃、12 000×g離心，留取細(xì)菌裂解上清，將裂解上清經(jīng)AKTA purifier 100系統(tǒng)進(jìn)行純化。首先將裂解上清上樣于已用緩沖液 1預(yù)平衡過的5 mL Ni-NTA柱，上樣速度0.5 mL/min。上樣完畢后，先用緩沖液 1充分洗柱，后用緩沖液 2(50 mmol/L 磷酸三鈉，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，400 mmol/L咪唑)進(jìn)行洗脫。洗脫后組份經(jīng)HiPrep 26/10 Desalting脫鹽至PBS中。

1.6 EGFP及R9-EGFP蛋白的提取

將上述融合蛋白加入SUMO蛋白酶1 (摩爾比20∶1)后4 ℃過夜酶切，酶切產(chǎn)物上樣于PBS平衡過的 Ni-NTA柱，流穿組分即為純化后的EGFP及R9-EGFP蛋白。

1.7 R9-EGFP穿膜活性的檢測

將EGFP及R9-EGFP稀釋至50 μg/mL添加至細(xì)胞密度為 1.5×106/孔、培養(yǎng)于 6孔板的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中，分別在孵育0.5、1、1.5、2 h后胰酶消化、PBS洗滌后重懸經(jīng)BD Aria流式細(xì)胞儀檢測 R9-EGFP穿膜效率 (激發(fā)波長488 nm，檢測波長 525 nm)。同時將 EGFP及R9-EGFP 稀釋濃度梯度 5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL 、 20 μg/mL 添 加 至 細(xì) 胞 密 度 為1.5×106/孔、培養(yǎng)于6孔板的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育1 h后胰酶消化、PBS洗滌后重懸進(jìn)行流式檢測R9-EGFP穿膜效率。

1.8 R9-EGFP穿膜活性的激光共聚焦觀測

將R9-EGFP稀釋至40 μg/mL添加至細(xì)胞密度為 1×106/孔、培養(yǎng)于 6孔板的 HepG2細(xì)胞爬片后培養(yǎng)基中，分別在孵育1.5 h，5 μg/mL DAPI孵育10 min后，PBS洗滌后經(jīng)激光共聚焦 (Leica TCSSP2AoBS)觀測。同時，以相同濃度 EGFP處理的HepG2細(xì)胞作為對照。

1.9 肝素對R9-EGFP穿膜效率的抑制試驗(yàn)

將肝素稀釋至 1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL添加至細(xì)胞密度為1.5×106/孔、培養(yǎng)于6孔板的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育30 min后，加入40 μg/mL R9-EGFP蛋白。同時只添加同樣濃度的 EGFP、R9-EGFP蛋白于另外兩個培養(yǎng)孔中，作為對照。繼續(xù)孵育1.5 h后，胰酶消化、PBS洗滌后重懸進(jìn)行流式檢測 R9-EGFP穿膜效率。

2 結(jié)果

2.1 SUMO-EGFP與SUMO-R9-EGFP的表達(dá)

SUMO-EGFP蛋白表達(dá)情況見圖 1，SUMO-R9-EGFP蛋白表達(dá)情況見圖2。由圖1、圖2可以看出兩種蛋白都不同程度以可溶形式表達(dá)，但蛋白在上清中相對表達(dá)量SUMO-R9-EGFP(30%)相對SUMO-EGFP (50%)略有降低。

2.2 EGFP及R9-EGFP的純化

EGFP和 R9-EGFP蛋白純化結(jié)果見圖 3。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示經(jīng)SUMO酶1酶切后再次經(jīng) Ni-NTA柱層析，均可得到高度純化的EGFP及R9-EGFP蛋白。電泳結(jié)果顯示R9-EGFP(29 kDa)蛋白分子量略大于EGFP (27 kDa)蛋白?；叶葤呙璺治鰞煞N蛋白純度均95%以上。

圖2 SUMO-R9-EGFP蛋白表達(dá)電泳分析Fig. 2 Expression analysis of the SUMO-R9-EGFP fusion protein. 1: protein molecular weight marker; 2:supernatant of SUMO-R9-EGFP cell lysates before induced; 3: precipitate of SUMO-R9-EGFP cell lysates before induced; 4: supernatant of SUMO-R9-EGFP cell lysates after induced; 5: precipitate of SUMO-R9-EGFP cell lysates after induced.

圖3 純化后EGFP及R9-EGFP蛋白電泳分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the mature EGFP and R9-EGFP peptides. 1: protein molecular weight marker;2: purified mature EGFP protein; 3: purified mature R9-EGFP protein.

2.3 R9-EGFP穿膜能力的檢測

流式檢測結(jié)果顯示只有 R9-EGFP蛋白可以檢測到熒光信號，單獨(dú)EGFP無信號。R9-EGFP信號強(qiáng)度呈現(xiàn)出時間 (圖4)及劑量 (圖5)依賴性。大約1.5 h后信號強(qiáng)度達(dá)到平臺期，與未處理及 EGFP處理相比大約 50%的細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)熒光信號。只添加EGFP蛋白的細(xì)胞未檢測到熒光信號。隨蛋白濃度增加 R9-EGFP處理細(xì)胞熒光信號強(qiáng)度呈遞增趨勢 (由9.6%遞增至48%)，而 EGFP處理細(xì)胞與空細(xì)胞相比熒光信號未有變化。

圖4 R9-EGFP時間梯度流式檢測結(jié)果Fig. 4 Incubation of HepG2 cells with time gradients of R9-EGFP. 1: HepG2 cells without protein; 2: HepG2 incubated with EGFP 2 h; 3: HepG2 incubated with R9-EGFP 0.5 h; 4: HepG2 incubated with R9-EGFP 1 h;5: HepG2 incubated with R9-EGFP 1.5 h; 6: HepG2 incubated with R9-EGFP 2 h.

圖5 R9-EGFP劑量梯度流式檢測結(jié)果Fig. 5 Incubation of HepG2 cells with dosage gradients of R9-EGFP. 1: HepG2 cells without protein; 2: HepG2 incubated with 20 μg/mL EGFP 1 h; 3: HepG2 incubated with 5 μg/mL R9-EGFP 1 h; 4: HepG2 incubated with 10 μg/mL R9-EGFP 1 h; 5: HepG2 incubated with 15 μg/mL R9-EGFP 1 h; 6: HepG2 incubated with 20 μg/mL R9-EGFP 1 h.

2.4 R9-EGFP穿膜活性的激光共聚焦觀測

激光共聚焦結(jié)果 (圖 6)顯示，單獨(dú) EGFP沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的能力，而 R9-EGFP (綠色)可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，聚集于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，沒有繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞核 (藍(lán)色區(qū)域)中。

2.5 肝素對R9-EGFP穿膜活性的抑制結(jié)果

肝素抑制結(jié)果 (圖 7)顯示，肝素對R9-EGFP的穿膜效果有明顯抑制作用，在2 μg/mL的濃度下可抑制50%左右的穿膜效率，隨著肝素濃度的增加抑制效果沒有明顯增加。由此可以推斷出R9的穿膜機(jī)制一定程度上依賴于與細(xì)胞表面的肝素結(jié)合，但并不完全依賴肝素一條途徑。

3 討論

目前將多肽類藥物、DNA等導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)普遍采用的手段有：物理方法，如電穿孔[11]、顯微注射[12]等；生物及化學(xué)方法，如洋地黃皂苷處理法[13]、成孔蛋白質(zhì)法[14]等；其他方法，如運(yùn)用免疫毒素[15]等蛋白質(zhì)載體、顆粒 (如脂質(zhì)體)包裹法[16]和病毒載體[17]等。但由于上述方法存在分子導(dǎo)入率低、易造成細(xì)胞損傷甚至死亡，以及細(xì)胞內(nèi)部無相應(yīng)靶向性等諸多不足，使得許多無生物膜通透性且易降解的親水性多肽、蛋白質(zhì)及寡核苷酸在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用大大受限。相比之下，細(xì)胞穿膜肽在這方面顯然具有很大優(yōu)勢：細(xì)胞膜親和性高，穿膜速度快，最重要的是對細(xì)胞膜沒有破壞性。將它們作為生物活性分子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)工具，應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床藥效評價等領(lǐng)域，具有誘人的前景。同時研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿膜肽可增加多肽類藥物的口服[18]、肺部[19]、腸道[20]給藥的吸收及生物利用度，基于細(xì)胞穿膜肽所開發(fā)的多肽藥物及給藥方式國內(nèi)外均有所研究。未來的幾十年里對于多肽類藥物穩(wěn)定性及體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究將是整個生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展趨勢，而細(xì)胞穿膜肽必將是其中研究熱點(diǎn)之一。

圖6 R9-EGFP激光共聚焦檢測結(jié)果Fig. 6 Confocal fluorescence microscopy of HepG2 cells incubated with R9-EGFP. 1: HepG2 incubated with 50 μg/mL EGFP 1.5 h; 2: HepG2 incubated with 50 μg/mL R9-EGFP 1.5 h.

圖7 肝素對R9-EGFP活性抑制實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果Fig. 7 Competitive inhibition of HepG2 uptaking R9-EGFP by heparin. 1: HepG2 incubated with 40 μg/mL EGFP 1.5 h; 2: HepG2 incubated with 40 μg/mL R9-EGFP 1.5 h; 3: HepG2 incubated with 1 μg/mL heparin 30 min and 40 μg/mL R9-EGFP 1.5 h;4: HepG2 incubated with 2 μg/mL heparin 30 min and 40 μg/mL R9-EGFP 1.5 h; 5: HepG2 incubated with 3 μg/mL heparin 30 min and 40 μg/mL R9-EGFP 1.5 h;6: HepG2 incubated with 4 μg/mL heparin 30 min and 40 μg/mL R9-EGFP 1.5 h.

但典型的細(xì)胞穿膜肽富含賴氨酸、精氨酸等極性氨基酸。當(dāng)?shù)鞍自诖竽c桿菌中高效表達(dá)時大量賴氨酸、精氨酸的存在不利于目的蛋白保持可溶形式。本研究在pSUMO載體的基礎(chǔ)上添加了R9，為防R9對EGFP蛋白造成影響兩者經(jīng)一個15個氨基酸的GS柔性連接肽相間隔。我們的結(jié)果顯示，相對于單獨(dú) EGFP，雖然 R9對 EGFP的可溶性表達(dá)有一定的影響，但在 SUMO分子伴侶的作用下仍有30%～40%融合蛋白呈現(xiàn)可溶狀態(tài)。我們在對細(xì)胞穿膜肽融合p53及CD基因表達(dá)時均得到相同的結(jié)論，且最終均未對蛋白活性造成明顯影響，為其他R9融合蛋白的表達(dá)及純化提供了依據(jù)。

經(jīng)SUMO酶1酶切及Ni-NTA柱層析后可得到高度提純、有活性、無殘留額外氨基酸的目的蛋白。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示單獨(dú)的EGFP不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，而R9可快速有效地?cái)y帶EGFP進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，穿膜效率呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，大約1.5 h后熒光信號達(dá)到最高。同時HepG2細(xì)胞MTT檢測發(fā)現(xiàn)無論EGFP還是R9-EGFP均沒有對細(xì)胞生長造成明顯抑制 (數(shù)據(jù)未顯示)。

目前關(guān)于穿膜肽的確切穿膜機(jī)制仍不明確。研究結(jié)果顯示富含精氨酸類的穿膜肽跨膜運(yùn)輸需與細(xì)胞表面的肝素等多糖結(jié)合才能發(fā)揮作用[21]，但不同實(shí)驗(yàn)室得出的結(jié)論并不一致[22-23]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多聚精氨酸的跨膜運(yùn)輸?shù)拇_與肝素的結(jié)合有關(guān)[24]，但并不完全依賴肝素一條途徑。同時將蛋白4 ℃過夜孵育顯示R9-EGFP沒有穿膜效果 (結(jié)果略)，這也說明多聚精氨酸的跨膜運(yùn)輸是一個耗能過程而不是簡單的直接跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

以往多聚精氨酸融合蛋白制備方法為包涵體變性復(fù)性或者體外合成多肽后經(jīng)二硫鍵共價偶聯(lián)。前者蛋白制備時間長，且存在復(fù)性率低、蛋白濃度低且末端殘留His標(biāo)簽 (已有文獻(xiàn)報(bào)道顯示His標(biāo)簽可將蛋白聚集于肝臟，具有潛在的肝細(xì)胞毒副作用[25])等原因。而后者費(fèi)用昂貴，不宜工業(yè)化生產(chǎn)蛋白。

經(jīng)pSUMO-R9/Ni-NTA系統(tǒng)可快速高效地得到R9融合蛋白，簡化純化步驟，方便對蛋白活性及功能的研究?？傊?，本研究結(jié)果證實(shí)了應(yīng)用pSUMO-R9/Ni-NTA系統(tǒng)表達(dá)R9融合蛋白的可行性，為多肽類藥物的研發(fā)提供了捷徑和新的思路。

但是絕大多數(shù)細(xì)胞穿膜肽自身沒有細(xì)胞特異性，如此便會造成應(yīng)用時的靶向性不足以及藥品的浪費(fèi)。因此未來開發(fā)具有組織器官靶向性、可胞內(nèi)定位的細(xì)胞穿膜肽類藥物并配合合適的劑型將是細(xì)胞穿膜肽研究的方向之一。

[1]Development Trends for Peptide Therapeutics[EB/OL]. [2011-12-26]. http://www.peptidetherapeutics.org/PTF_Summary.

[2]Lipinski CA, Lombardo F, Dominy BW, et al.Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev, 1997, 23(1–3): 3-25.

[3]Hopkins AL, Groom CR. The druggable genome.Nat Rev Drug Discov, 2002, 1(9): 727-730.

[4]Green M, Loewenstein PM. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus Tat transactivator protein.Cell, 1988, 55(6): 1179-1188.

[5]Frankel AD, Pabo CO. Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus. Cell,1988, 55(6): 1189-1193.

[6]Wender PA, Mitchell DJ, Pattabiraman K, et al.The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters. Proc Natl Acad Sci USA,2000, 97(24): 13003-13008.

[7]Wouter PR, Petra HB, Parvesh W, et al.Preferential uptake of L-versus D-amino acid cell-penetrating peptides in a cell type-dependent manner. Chem Biol, 2011, 18(8): 1000-1010.

[8]Marblestone JG, Edavettal SC, Lim Y, et al.Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Sci,2006, 15(1): 182-189.

[9]Butt TR, Edavettal SC, Hall JP, et al. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expr Purif, 2005, 43(1): 1-9.

[10]Malakhov MP, Mattern MR, Malakhov OA, et al.SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins.Struct Funct Gen, 2004, 5(1/2): 75-86.

[11]Deora AA, Diaz F, Schreiner R. Eff i cient electroporation of DNA and protein into conf l uent and differentiated epithelial cells in culture. Traffic,2007, 8(10): 1304-1312.

[12]Lappe S, Maas C, Kneussel M. Microinjection into cultured hippocampal neurons: a straightforward approach for controlled cellular delivery of nucleic acids, peptides and antibodies. J Neurosci Methods,2008, 175(1): 88-95.

[13]Lindnér PG, Heath D, Howell SB, et al. Digitonin enhances the efficacy of carboplatin in liver tumour after intra-arterial administration. Cancer Chemother Pharmacol, 1997, 40(50): 444-448.

[14]Parker MW, Feil SC. Pore-forming protein toxins:from structure to function. Prog Biophys Mol Biol,2005, 88(1): 91-142.

[15]Zheng L, Tao Y, Ping Z, et al. Immunotoxins and cancer therapy. Cell Mol Immunol, 2005, 2(2):106-112.

[16]Zelphati O, Wang Y, Kitada S, et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J Biol Chem, 2001, 276(37): 35103-35110.

[17]Boeckle S, Wagner E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modif i cation of viral vectors and synthesis of artif i cial virus vector systems. AAPS J,2006, 8(4): E731-E742.

[18]El-Sayed K, Mariko M. Oral biodrug delivery using cell-penetrating peptide. Adv Drug Deliv Rev,2012, 64(6): 531-539.

[19]Leena NP, Jeffrey W, Kwang J, et al. Conjugation with cationic cell-penetrating peptide increases pulmonary absorption of insulin. Mol Pharm, 2009,6(2): 492-503.

[20]Morishita M, Kamei N, Ehara J, et al. A novel approach using functional peptides for eff i cient intestinal absorption of insulin. J Control Release,2007, 118(2): 177-184.

[21]Schmidt N, Mishra A, Lai GH et al. Arginine-rich cell-penetrating peptides. FEBS Lett, 2010, 584(9):1806-1813.

[22]Richard JP, Melikov K, Brooks P, et a1. Cellular uptake of un-conjugated, TAT peptide involves clathrin-dependent endocytosis and heparin sulfate receptors. J Biologic Chem, 2005, 280(15):15300-15306.

[23]Wadia JS, Stan RV, Dowdy SF. Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat Med, 2004, 10(3): 310-315.

[24]Fuchs SM, Raines RT. Pathway for polyarginine entry into mammalian cells. Biochemistry, 2004,43(9): 2438-2444.

[25]?z?ren N, Kim K, Burns TF, et al. The Caspase 9 inhibitor Z-LEHD-FMK protects human liver cells while permitting death of cancer cells exposed to tumor Necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. Cancer Res, 2000, 60(22): 6259-6265.