李倩，趙心清，Jin-Soo Kim，白鳳武

1 大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024

2 大連大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622

3 ToolGen, Inc, Seoul, 153-023, South Korea

釀酒酵母的乙醇耐性對于超高濃度發(fā)酵及連續(xù)發(fā)酵過程中保持較高的細胞活性非常重要。但釀酒酵母乙醇耐性機制復雜，與乙醇耐性相關的基因有 200多個[1-2]，依靠傳統(tǒng)的單基因操作或局部代謝支路改造很難得到理想的表型，因此本實驗考慮使用人工轉(zhuǎn)錄因子 (鋅指蛋白文庫)[3-4]來獲得工業(yè)釀酒酵母的高乙醇耐受突變體，并比較其與傳統(tǒng)的物理化學誘變方法的正突變率及遺傳穩(wěn)定性等指標。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

工業(yè)釀酒酵母Sc4126，本實驗室保存。

YPD培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母粉10；固體培養(yǎng)基添加2% (V/V)瓊脂粉。

SD 基本培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 10，不含氨基酸的酵母氮堿 (YNB)6.7。

人工轉(zhuǎn)錄因子相關實驗固體和液體培養(yǎng)基分別添加 300 μg/mL 和 100 μg/mL 的 G418。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖100，蛋白胨8，酵母粉6。

所有搖瓶培養(yǎng)條件為30 ℃，150 r/min。平板均在30 ℃下培養(yǎng)2～5 d。

1.2 方法

1.2.1 三種育種方法處理菌體

紫外誘變 (UV)參考文獻[5]處理菌體，選取合適照射時間使存活率在 50%與 10%左右。等離子體誘變 (Plasma)參考文獻[6]處理菌體，選取合適處理時間使存活率在 50%和 10%左右。人工轉(zhuǎn)錄因子 (ATF)文庫 由韓國 ToolGen公司 Jin-Soo Kim教授提供[4]，結(jié)構如圖1所示。電轉(zhuǎn)鋅指蛋白文庫質(zhì)粒到Sc4126中，篩選使用G418。

圖1 人工轉(zhuǎn)錄因子文庫主要元件Fig. 1 Key elements of the artificial transcription factor library (ATF).

1.2.2 乙醇耐性突變株的篩選和驗證

YPD培養(yǎng)基過夜活化宿主菌Sc4126后添加無水乙醇使終濃度達到 20% (V/V)培養(yǎng)不同時間涂布 YPD平板，選擇無菌落長出時對應的處理時間T0來作為耐性篩選條件。

將3種方法得到的突變株用YPD培養(yǎng)基從各自的平板上完全洗下來，加入無水乙醇至終濃度20% (V/V)，乙醇沖擊T0時間后涂布含10%乙醇的YPD平板。

復篩時將每種育種方法得到的突變株中菌落最大的挑出，在YPD中過夜培養(yǎng)后調(diào)整菌株OD600至相同數(shù)值，一方面點滴10% (V/V)乙醇平板和普通 YPD平板，另一方面以20% (V/V)接種量轉(zhuǎn)接到含20% (V/V)乙醇的SD基本培養(yǎng)基沖擊1～5 h計算存活率，從而定性和定量評估突變體乙醇耐受性。

1.2.3 突變株遺傳穩(wěn)定性驗證

在每種突變方法獲得的突變株中隨機選取 15個突變體，接入 YPD培養(yǎng)基 24 h培養(yǎng)后以 1%(V/V)接種量接至新鮮YPD中，如此傳代10次。將最后一次傳代的菌體與活化培養(yǎng)的元代突變株調(diào)至相同的OD600值，進行兩組驗證：一組稀釋合適倍數(shù)涂布含10% (V/V)乙醇YPD平板，培養(yǎng)3 d后計算菌落形成單位 (CFU)；另一組分別接入含8%(V/V)乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng) 36 h后，測量OD600。如果在兩組實驗中，最后一次傳代的突變株與元代突變株的結(jié)果差異均在40%以上，則認為此突變株發(fā)生了回復突變。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種改造方法菌體處理條件的確定

確定了乙醇時間T0為2.5 h。人工轉(zhuǎn)錄因子文庫使用了兩種效應域：激活域 (Gal4轉(zhuǎn)錄因子)和抑制域 (Ume6轉(zhuǎn)錄因子)[4]。根據(jù)兩種物理誘變存活曲線，考慮到過高的致死率容易導致高比例的負突變[5]，選擇存活率接近50%和10%的處理時間進行后續(xù)實驗，即紫外誘變分別選擇45 s和90 s處理，等離子體誘變分別選擇1.5 min和3.5 min。

2.2 三種育種方法效果比較

每種方法出發(fā)菌落數(shù)都在10 000株以上，通過足夠大的樣本量保證結(jié)果有統(tǒng)計意義。一般微生物的自發(fā)突變率僅有10-6～10-8[7]，如表1所示，幾種育種方法效率達到10-4以上，其中人工轉(zhuǎn)錄因子文庫技術正突變率更是高達10-2，比自發(fā)突變率高了至少4個數(shù)量級，也高出紫外誘變和等離子體誘變1～2個數(shù)量級。在兩種人工鋅指蛋白文庫中，鋅指序列后接抑制元件Ume6的突變比率比后接激活域Gal4的高26%，推測可能原因是與乙醇耐性相關的天然鋅指蛋白多是通過抑制靶基因表達發(fā)揮功能，這與Ume6抑制元件功能相似，因此導入這類鋅指蛋白的菌株更易篩選得到乙醇耐性提高的表型[8-9]。

進一步對每種方法得到的菌落直徑最大的突變體進行了乙醇耐受的定性與定量測試。圖2為乙醇平板點滴實驗結(jié)果，在 10% (V/V)平板上對照菌只能生長1～2個稀釋梯度，而突變株均可以生長3～4個稀釋梯度。如圖3所示20% (V/V)乙醇沖擊實驗結(jié)果，3種方法獲得的突變株較對照乙醇耐受性有了顯著提高。以1 h為例，UV誘變、ATF方法和等離子體誘變得到的突變體分別較對照存活率提高了23.4%、19.1%和14.5%，3種方法均達到了提高乙醇耐性的目的。

2.3 三種育種方法獲得的突變株遺傳穩(wěn)定性比較

在每組15個突變株中，紫外誘變組有7個發(fā)生回復突變，等離子體誘變組有4個，而人工轉(zhuǎn)錄因子組只有1個回復，遠低于物理誘變，說明人工轉(zhuǎn)錄因子方法得到的突變株較兩種物理誘變方法有遺傳穩(wěn)定的特點。

表1 三種誘變方法效率比較Table 1 Efficiency of three mutagenesis approaches using S. cerevisiae Sc4126

圖2 突變體乙醇耐性的比較Fig. 2 Analysis of ethanol tolerance of mutants on YPD plates (A)and YPD plates with 10% (V/V)ethanol supplement (B).

圖3 紫外誘變 (UV)、等離子體誘變 (Plasma)和人工轉(zhuǎn)錄因子方法 (ATF)篩選到的突變體在 20% (V/V)乙醇沖擊下細胞存活率曲線Fig. 3 Viability of mutants obtained by UV treatment,plasma mutagenesis and ATF screening under ethanol-shock treatment at the concentration of 20% (V/V).

3 結(jié)論與展望

利用人工轉(zhuǎn)錄因子 (人工鋅指蛋白)文庫技術成功獲得200余株乙醇耐性提高的工業(yè)釀酒酵母，正突變率高達10-2，相比紫外誘變、介質(zhì)阻擋等離子體誘變，具有正突變率高且回復突變率低的優(yōu)點。人工轉(zhuǎn)錄因子手段還可以進行釀酒酵母其他脅迫耐性表型的改造，如耐高溫和高滲等。獲得好的微生物突變體后，可考慮使用誘導型啟動子來控制效應域的轉(zhuǎn)錄，從而控制基因轉(zhuǎn)錄的強度和表達時間，達到對生長和代謝的協(xié)同控制。

致謝：感謝修志龍教授提供介質(zhì)阻擋等離子體設備；感謝陳慧黠博士對等離子體誘變部分的實驗給予的幫助和指導；感謝博士生王亮提供的實驗思路和實驗協(xié)助。

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