陳江燕，黃榮，陶穎，黃媛，羅英英，黃愛龍，胡接力

重慶醫(yī)科大學(xué) 感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016

乙型肝炎病毒 (HBV) 是一種重要的病原體，可導(dǎo)致一系列慢性肝病[1-2]。HBV為直徑42 nm的球形顆粒[3]，呈雙層殼結(jié)構(gòu)，外殼主要由3種表面蛋白 (HBs) 構(gòu)成[4]，內(nèi)層核衣殼由核心蛋白 (HBc) 組成，為正20面體結(jié)構(gòu)[5]，該結(jié)構(gòu)包含90或120個(gè)HBc二聚體，每個(gè)二聚體由HBc單體通過二硫鍵連接[6-7]。HBc由4個(gè)α螺旋 (aa13-30，aa50-60-78，aa82-93-110，aa112-123-128) 和 C端精氨酸區(qū)組成[8]。第 2和第3個(gè)α螺旋轉(zhuǎn)折形成釘狀突起，aa80是尖突頂，位于核衣殼最表面 (圖 1)[9-11]。HBc在HBV復(fù)制過程中必不可少，它所構(gòu)成的核衣殼是包裝前基因組 RNA (Pregenomic-RNA，pgRNA)和病毒聚合酶的場(chǎng)所[12]，另外，HBc還介導(dǎo)病毒基因組DNA進(jìn)入細(xì)胞核，繼而生成共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA (Covalently closed circled DNA，cccDNA)作為復(fù)制的初始模板[13]。

圖1 HBc蛋白二維結(jié)構(gòu)示意圖[10]Fig. 1 Diagram of HBc structure[10]. (A) HBc monomer, aa78-82 is at the spike. (B) HBc dimer.

HBc因其作用重要，一直是HBV復(fù)制研究中的重要對(duì)象，然而，由于缺乏穩(wěn)定且特性好的抗HBc抗體，很多研究不便開展。本研究針對(duì)這一問題，擬利用綠色熒光蛋白 (EGFP) 對(duì)HBc進(jìn)行基因工程改造，試圖達(dá)到以下目的：1) 能對(duì) HBc表達(dá)情況進(jìn)行監(jiān)控；2)使得用免疫學(xué)方法檢測(cè) HBc以及捕獲核心顆粒 (含有HBV基因組 DNA及聚合酶的核衣殼)成為可能；3)與此同時(shí)，不影響HBc自身功能，即經(jīng)過改造的HBc仍能支持HBV復(fù)制。為達(dá)到以上目的，我們認(rèn)為，EGFP標(biāo)簽需表達(dá)于核衣殼表面，以便被抗 EGFP抗體識(shí)別和捕獲。從核衣殼的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)[8]可知，位于其最表面的部分是HBc釘突部位 (aa78～82)，而不是C末端或N末端。因此，若在釘突位置插入EGFP，有可能使其暴露于核衣殼表面。但是，在一個(gè)蛋白的中間位置插入另一蛋白序列，有可能使這兩種蛋白的三維結(jié)構(gòu)都受到影響，不能正確折疊，從而影響甚至破壞二者的功能。Kratz等[14]的研究表明，對(duì)于截去C末端40 aa的HBc，當(dāng)其釘突處aa79～80替換成GFP時(shí)，超過40%的融合GFP折疊正確，能產(chǎn)生綠色熒光，同時(shí)亦能形成與天然核衣殼類似的顆粒結(jié)構(gòu)，然而，截去C末端的 HBc并不能支持 HBV復(fù)制[15]，我們?cè)诒狙芯恐袑⒁酝暾鸋Bc為基礎(chǔ)進(jìn)行改造，考察這些融合蛋白是否保留了HBc的正常功能，同時(shí)，我們還探討了不同類型接頭以及不同大小插入片段對(duì)HBc蛋白功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒 pCH9/3091由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染病研究所蘭林博士饋贈(zèng)，德國 Nassal[16]課題組構(gòu)建；HEK293細(xì)胞、質(zhì)粒pEGFP-N1為本實(shí)驗(yàn)室保存；Southern blotting檢測(cè)試劑盒、Xteme HP轉(zhuǎn)染試劑購自羅氏公司；內(nèi)切酶DpnⅠ購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建 HBV1.1c－質(zhì)粒

采用不依賴酶切與連接的分子克隆方法(RLIC)[17-18]。以質(zhì)粒pCH9/3091為模板，設(shè)計(jì)突變引物，使其HBc第40位氨基酸突變?yōu)榻K止密碼，上游引物為：5'-GATACCGCCTCAG CTCTGTATCGGTAAGCCTTAGAGTCTCCTGA GCATTG-3'，下游引物為：5'-CTCGTCGTCT AACAACAGTAGTCT-3'，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。用QIAGEN 膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段。回收片段帶有突變堿基，作為大引物，用來替換模板質(zhì)粒pCH9/3091中相應(yīng)片段。反應(yīng)體系：300 ng回收片段，50 ng pCH9/3091模板，0.5 μL PrimeSTAR 聚合酶等。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，18個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用Roche PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化，取13 μL純化產(chǎn)物用Dpn Ⅰ于37 ℃消化5 h，取2 μL消化后產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細(xì)胞，獲得的克隆測(cè)序鑒定。

1.2.2 構(gòu)建HBc質(zhì)粒

以 pCH9/3091為模板，設(shè)計(jì)引物，上游引物為：5'-CAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG GAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTAC-3'；下游引物為：5'-GTACAAAGACCTTTAACCTAAT CTCCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG-3'，作反向替換 (等同大片段缺失突變)，具體方法與前述類似。挑取克隆測(cè)序鑒定。

1.2.3 其他重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將HBc aa79～80替換成EGFP有兩種設(shè)計(jì)：1) HBc gfp-flex，由柔性接頭連接EGFP兩端并插入HBc中 (替換aa79～80)。首先以pEGFP-N1為模板，用引物FHBc gfp-flex1、RHBc gfp-flex1 PCR擴(kuò)增，取0.1 μL擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用引物FHBc gfp-flex2、RHBc gfp-flex2再次PCR擴(kuò)增，得到兩端加上柔性接頭的 EGFP基因片段，其末端帶有與 HBc aa79～80兩側(cè)序列同源的序列，然后以該片段為大引物，替換插入到 HBc中。方法類似 1.2.1。2)HBc gfp-heli，在 HBc gfp-flex基礎(chǔ)上，EGFP兩端各增加一段α螺旋的剛性接頭，改變?nèi)诤系鞍组g的連接方式。構(gòu)建方法大體與1)類似，但因該剛性接頭序列較長(zhǎng)且多重復(fù)堿基，難以直接用PCR將外側(cè)序列加到上一輪PCR擴(kuò)增片段兩側(cè) (即heli2引物不能較好擴(kuò)增heli1的擴(kuò)增產(chǎn)物)，因此需在每輪擴(kuò)增后，增加一次克隆過程，共進(jìn)行了3次克隆。

此外，我們還在HBc gfp-flex基礎(chǔ)上，將插入的外源片段逐步縮短，構(gòu)建 3種重組質(zhì)粒：1) HBc gfp15-flex，為HBc gfp-flex 刪除EGFP中間部分，僅保留 EGFP15個(gè)氨基酸的重組HBc。2) HBc flex，在HBc gfp15-flex的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將重組蛋白減短，融合多肽為2個(gè)G4S。3) HBc 7980-為第79、80位氨基酸缺失的HBc蛋白。均采用與RLIC原理相同的反向替換法。

1.2.4 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：HEK293細(xì)胞使用含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基，于 37 ℃，含 5%CO2，相對(duì)濕度大于95%的無菌孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒前，先將細(xì)胞接種于 6 孔板，密度約為1.5×105個(gè)/孔，培養(yǎng)約 20 h，換新鮮培養(yǎng)基。配制轉(zhuǎn)染體系：質(zhì)粒與脂質(zhì)體以1 : 3的比例混勻 (2 μg DNA : 6 μL 脂質(zhì)體)，轉(zhuǎn)染各孔，24 h后換液。繼續(xù)培養(yǎng)4 d，收細(xì)胞。

表1 其他重組質(zhì)粒構(gòu)建所用引物Table 1 Primers used in the construction of other recombinants

1.2.5 Southern blotting檢測(cè)HBV DNA復(fù)制中間體

細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 d后，提細(xì)胞內(nèi)核心顆粒HBV DNA：用500 μL細(xì)胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA，1% NP40，50 mmol/L NaCl，2%蔗糖)37 ℃孵育10 min，收集裂解物，15 000×g離心 4 min，取上清，加 5 μL 1 mol/L MgCl，50 U DNase I于 37 ℃孵育 5 h，加 200 μL沉淀劑(35% PEG 8000, 1.5 mol/L NaCl)，置冰上40 min，13 000×g離心10 min后棄去上清，再用Proteinase K消化過夜，經(jīng)酚氯仿抽提，異丙醇沉淀，將得到的產(chǎn)物溶于8 μL超純水，用Southern blotting檢測(cè)HBV DNA，具體操作步驟詳見文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果

2.1 HBV1.1c-及HBc質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建HBc表達(dá)缺失的HBV 1.1倍體的目的，是為了后續(xù)檢測(cè)各種經(jīng)過改造的HBc是否保留正常功能，即支持HBV復(fù)制。我們?cè)诤?.1倍體 HBV基因組的 pCH9/3091基礎(chǔ)上，將 HBc蛋白的第40個(gè)氨基酸突變成終止密碼，同時(shí)不干擾HBV其他基因的表達(dá)[20](圖2)。

圖2 HBV1.1c－及HBc的構(gòu)建及功能鑒定Fig. 2 Construction of HBV1.1c－ and HBc and functional characterization. (A)The principle of RLIC to delete a fragment from a plasmid. (B)Diagram of pCH9/3091, HBV1.1c－ and HBc. (C)Detection of HBV DNA by Southern blotting. M: marker; 1–4: HBV DNA extracted from HEK293 cells cotransfected with different clones of HBc and HBV1.1c－. 1: HBc1+HBV1.1c－4; 2: HBc1+HBV1.1c－5; 3: HBc3+HBV1.1c－4; 4: HBc3+HBV1.1c－5; 5 and 6:negative control (transfection only with HBV1.1c－4 or HBV1.1c－5). HBc1 and HBc3 are two different clones of HBc. HBV1.1c－4 and HBV1.1c－5 are two different clones of HBV1.1c－. ssDNA: single stranded DNA.

HBc質(zhì)粒僅需帶有 HBVc基因及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，我們以pCH9/3091為基礎(chǔ)，使用類似RLIC原理的方法 (圖2)，具體為：設(shè)計(jì)一對(duì)完全互補(bǔ)的引物，引物兩端序列分別與缺失目標(biāo)序列兩端同源，用該對(duì)引物進(jìn)行替換反應(yīng)，以去掉除了HBc及終止信號(hào)[21]以外的其他 HBV DNA。選擇測(cè)序正確的HBc克隆質(zhì)粒 HBc1、HBc3，分別與 HBV1.1c－克隆質(zhì)粒HBV1.1c－4、HBV1.1c－5共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，對(duì)二者進(jìn)行功能鑒定，二者具有正常功能的標(biāo)準(zhǔn)為：能支持 HBV復(fù)制。HBV復(fù)制中間體的Southern blotting 結(jié)果顯示(圖2)，HBc3 與HBV1.1c－4/5共轉(zhuǎn)染后，可觀察到復(fù)制中間體形成[22]，提示二者均保留了正常功能，支持HBV復(fù)制。

2.2 釘突部位融合EGFP的重組HBc功能鑒定

圖3 HBc-EGFP的功能鑒定Fig. 3 Functional characterization of HBc-EGFP. (A)Structure of HBc, HBc gfp-flex and HBc gfp-heli. (B)Observation of green fluorescence in HEK293 cells transfected with different constructs (a, b: HBc gfp-flex; c, d:HBc gfp-heli). (C)Detection of HBV replication intermediates by Southern blotting: M: marker; 1: HBc+HBV1.1c－;2: HBc gfp-flex+HBV1.1c－; 3: HBc gfp-heli.+HBV1.1c－.

圖4 HBc aa79～80短片段替換及缺失對(duì)其功能的影響Fig. 4 Impact of short insertion or deletion at aa79-80 of HBc on its function. (A) The structure and functional assay of HBc gfp15-flex. M: marker; 1: positive control HBc+HBV1.1c－; 2: HBc gfp15-flex+HBV1.1c－. (B) The structure and functional assay of HBc flex. (C)The structure and functional assay of HBc7980-.

在將HBc aa79-80替換成EGFP時(shí)，為了盡可能降低插入蛋白和本體蛋白在三維結(jié)構(gòu)上的相互干擾，以減小對(duì)各自功能的影響，我們?cè)诓迦胛恢迷O(shè)計(jì)了兩種連接接頭。一種是柔性接頭，即在EGFP與HBc的兩側(cè)連接處，分別以多甘氨酸2G4S連接[14](HBc gfp-flex，圖3)，另一種是柔性+剛性接頭，即在2G4S與EGFP之間，分別增加一段可形成 α螺旋的序列 A(EAAAK)4A[23](HBc gfp-heli，圖3)。測(cè)序正確的HBc gfp-flex/HBc gfp-heli重組質(zhì)粒，分別與HBV1.1c－以1 : 1 (摩爾比)共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后開始觀測(cè)到熒光，隨時(shí)間延長(zhǎng)，熒光增強(qiáng)。圖3所示為48 h的熒光情況。HBc gfp-flex產(chǎn)生的熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布均勻，強(qiáng)度較轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1弱，提示受融合蛋白間的相互影響，正確折疊的EGFP減少。HBc gfp-heli產(chǎn)生的熒光表現(xiàn)不同，在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)分散的點(diǎn)狀熒光。

2.3 aa79-80位置短片段替換影響 HBc的正常功能

由于釘突部位融合EGFP的重組HBc可產(chǎn)生綠色熒光，但不支持HBV復(fù)制，提示盡管至少部分 EGFP可進(jìn)行正確折疊 (正確的三維結(jié)構(gòu)是其發(fā)熒光的前提)[24]，但至少部分HBc未獲得正確折疊。我們接下來希望知道，是否是因?yàn)椴迦氲腅GFP片段過大，而影響了HBc的正常功能？為此，我們將插入片段逐步縮小，使替換的片段分別為EGFP的15個(gè)aa+柔性接頭 (HBc gfp15-flex)，10aa柔性接頭 (HBc flex)，以及僅缺失aa79～80(HBc 7980-)。將這些質(zhì)粒分別與 HBV1.1c－共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞，然后提取細(xì)胞內(nèi)核心顆粒DNA，Southern blotting檢測(cè)HBV復(fù)制中間體。結(jié)果顯示，這3種結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒均未檢測(cè)到病毒復(fù)制信號(hào)，而陽性對(duì)照 (野生型HBc+HBV1.1c－)可見明顯復(fù)制。

3 討論

HBc三維結(jié)構(gòu)中的釘突部位 (aa78～82)位于核衣殼表面，其部位的抗原充分暴露，非常有利于與抗體結(jié)合，常作為植入外源抗原的部位[25]，但通常植入這些抗原的目的，是為了利用HBc可聚合成較大顆粒的特性，獲得更好的免疫原性，并不關(guān)心是否保留HBc的主要功能，即支持 HBV復(fù)制。本研究旨在對(duì) HBc釘突aa79～80處進(jìn)行改造，插入標(biāo)記蛋白EGFP，希望在對(duì) HBc進(jìn)行標(biāo)記的同時(shí)，保留 HBc支持HBV復(fù)制的正常功能。

在本研究中，我們首先采用類似RLIC原理的大片段缺失方法，構(gòu)建了一系列重組質(zhì)粒，包括HBc及3種HBc-EGFP截短質(zhì)粒。該方法利用同源序列退火和線性擴(kuò)增，原理本質(zhì)上仍是RLIC，區(qū)別只是用短的片段替換目標(biāo)載體上較長(zhǎng)的片段，而RLIC是用大的片段替換載體上的較短區(qū)域，結(jié)果一個(gè)是基因缺失，一個(gè)是基因插入。該方法使用時(shí)，對(duì)缺失片段大小及缺失位置無限制，本研究中的幾種缺失片段大小為數(shù)百或數(shù)千bp，這些結(jié)果顯示，RLIC是一種基因工程改造的有力工具。

我們?cè)诓迦氲鞍變啥嗽O(shè)計(jì)了兩種連接接頭，一種柔性接頭和一種剛性接頭。兩種重組HBc轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后均能發(fā)出綠色熒光，提示至少部分EGFP均獲得了正確折疊。然而，兩種 HBc-EGFP重組體所呈現(xiàn)的熒光表現(xiàn)明顯不同，柔性接頭連接者熒光均勻，而剛性接頭者熒光呈分散點(diǎn)狀，我們推測(cè)，導(dǎo)致熒光點(diǎn)狀分布的原因可能有：1) HBc-EGFP分子間自發(fā)聚集成團(tuán)，導(dǎo)致熒光成點(diǎn)狀；2) 重組蛋白滯留在某種細(xì)胞器，不能進(jìn)行正常運(yùn)轉(zhuǎn)。究竟何種機(jī)制導(dǎo)致這種表型尚待進(jìn)一步研究，無論如何，這種表型的改變應(yīng)該與剛性接頭的加入有關(guān)。在對(duì) HBc-EGFP的功能進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，我們未能檢測(cè)到病毒復(fù)制信號(hào)，可能的原因是融合的EGFP破壞了 HBc的正確結(jié)構(gòu)，或者僅有少部分保留了正確結(jié)構(gòu)而不足以被檢測(cè)到。為了驗(yàn)證是否因?yàn)镋GFP為較大的分子 (238 aa)而影響了HBc蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，我們縮短融合蛋白分子，其中一種僅為缺失aa79～80，發(fā)現(xiàn)這些分子仍不支持HBV復(fù)制，這提示aa79～80對(duì)于維持HBc的正常功能較為重要。Matthias等[26]證明，HBc蛋白缺失第80位氨基酸可支持HBV復(fù)制，因此我們認(rèn)為aa79可能為HBc支持HBV復(fù)制不可缺失的氨基酸。

致謝 感謝美國 Drexel 大學(xué)醫(yī)學(xué)院 Dr. Guo Haitao對(duì)本文的審閱。

[1]Liaw YF, Chu CM. Hepatitis B virus infection.Lancet, 2009, 373(9663): 582–589.

[2]McMahon B. Epidemiology and natural history of hepatitis B. Semin Liver Dis, 2005, 25(Suppl 1):3–8.

[3]Dane DS, Cameron CH and Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen- associated hepatitis. Lancet,1970, 295(7649): 695–698.

[4]Heermann KH, Goldmann U, Schwarz W, et al.Large surface proteins of hepatitis B virus containing the pre-s sequence. J Virol, 1984, 52(2):396–402.

[5]Steven AC, Conway JF, Cheng NQ, et al. Structure,assembly and antigenicity of hepatitis B virus capsid proteins. Adv Virus Res, 2005, 64:125–164.

[6]Chang C, Zhou S, Ganem D, et al. Phenotypic mixing between different hepadnavirus nucleocapsid proteins reveals C protein dimerization to be cispreferential. J Virol, 1994,68(8): 5225–5231.

[7]Pumpens P, Grens E. Hepatitis B core particles as a universal display model: a structure-function basis for development. FEBS Lett, 1999, 442(1):1–6.

[8]Crowther RA, Kiselev NA, Bottcher B, et al.Three-dimensional structure of hepatitis B virus core particles determined by electron cryomicroscopy. Cell, 1994, 77(6): 943–950.

[9]Konig S, Beterams G, Nassal M. Mapping homologous interaction sites in the hepatitis B virus core protein. J Virol, 1998, 72(6):4997–5005.

[10]Wynne SA, Crowther RA, Leslie AGW. The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid. Molecular Cell, 1999, 3(6): 771–780.

[11]Conway JF, Cheng N, Zlotnick A, et al. Hepatitis B virus capsid: localization of the putative immunodominant loop (residues 78 to 83)on the capsid surface, and implications for the distinction between c and e-antigens. J Mol Biol, 1998,279(5): 1111–1121.

[12]Pollack JR, Ganem D. An RNA stem-loop structure directs hepatitis B virus genomic RNA encapsidation. J Virol, 1993. 67(6): 3254–3263.

[13]Yeh CT, Liaw YF, Ou JH. The arginine-rich domain of hepatitis B virus precore and core proteins contains a signal for nuclear transport. J Virol, 1990, 64(12): 6141–6147.

[14]Kratz PA, Bottcher B, Nassal M. Native display of complete foreign protein domains on the surface of hepatitis B virus capsids. Biochemistry, 1999,96(5): 1915–1920.

[15]Gallina A, Bonelli F, Zentilin L, et al. A recombinant hepatitis B core antigen polypeptide with the protamine-like domain deleted selfassembles into capsid particles but fails to bind nucleicacids. J Virol, 1989, 63(11): 4645–4652.

[16]Nassal M. The arginine-rich domain of the hepatitis B virus core protein is required for pregenome encapsidation and productive viral positive! strand DNA synthesis but not for virus assembly. J Virol, 1992, 66(7): 4107–4116.

[17]Huang Y, Tao Y, Zhang WL, et al. A new method for DNA molecular cloning. Sci Sin Vitae, 2011,41(9): 722–729 (in Chinese).黃媛, 陶穎, 張文露, 等. 一種新的 DNA 分子克隆方法. 中國科學(xué), 2011, 41(9): 722–729.

[18]Aslanidis C, de Jong PJ. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res, 1990, 18(20): 6069–6074.

[19]Cui J, Hu JL, Zhang WL, et al. Analysis of hepatitis B virus replication in vitro by chemiluminescent detection method.Biotechnology, 2009, 19(2): 44–46 (in Chinese).崔靜, 胡接力, 張文露, 等. 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)體外HBV復(fù)制. 生物技術(shù), 2009, 19(2): 44–46.

[20]Seeger C, Mason WS. Hepatitis B virus biology.Microbiol Mol Biol, 2000, 64(1): 51–68.

[21]Paran N, Ori A, Haviv I. A composite polyadenylation signal with TATA box function.Mol Cell Biol, 2000, 20(3): 834–841.

[22]Rieger A, Nassal M. Specific hepatitis B virus minus-strand DNA synthesis requires only the 5′encapsidation signal and the 3′-proximal direct repeat DR1. J Virol, 1996, 70(1): 585–589.

[23]Arai R, Ueda H, Kitayama A, et al. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Eng, 2001,14(8): 529–532.

[24]Niwa H, Inouye S, Hirano T, et al. Chemical nature of the light emitter of the aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA,1996, 93(24): 13617–13622.

[25]Borisova G, Arya B, Dislers A, et al. Hybrid hepatitis B virus nucleocapsid bearing an immunodominant region from hepatitis B virus surface antigen. J Virol, 1993, 67(6): 3696–3701.

[26]Koschel M, Oed D, Gerelsaikhan T, et al.Hepatitis B virus core gene mutations which block nucleocapsid envelopment. J Virol, 2000, 74(1):1–7.