萬青，曹偉佳，張常青，劉嶸明，梁麗亞，陳可泉，馬江鋒,2，姜岷

1 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程與國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816

2 中國石化揚(yáng)子石油化工有限公司南京研究院，江蘇 南京 210048

大腸桿菌Escherichia coli AFP111是NZN111(△pflAB△ldhA)的ptsG自發(fā)突變株，其恢復(fù)了在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力[1-2]。在AFP111中，轉(zhuǎn)化1 mol木糖合成丁二酸的過程中凈產(chǎn)生1.67 mol的ATP，但是轉(zhuǎn)化1 mol的木糖合成丁二酸的過程中實(shí)際需要2.67 mol的ATP[3-4]。因此，ATP供給不足導(dǎo)致AFP111不能代謝木糖并合成丁二酸[5]。本課題組為了獲得可以在厭氧條件下代謝木糖的菌株，嘗試用誘變的方法來選育目的菌株。

常溫常壓等離子體誘變系統(tǒng) (ARTP)由清華大學(xué)研發(fā)，通過 ARTP所產(chǎn)生的射線和活性粒子束對菌株的遺傳物質(zhì)造成損傷，從而引起菌株的突變[6-7]。ARTP具有射流溫度低、產(chǎn)生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡易、成本低、與生物大分子和細(xì)胞作用明顯等優(yōu)點(diǎn)[8]，已成為快速突變微生物基因組的有效方法。本研究通過利用ARTP常溫常壓等離子體誘變系統(tǒng)對出發(fā)菌株AFP111進(jìn)行誘變，通過以木糖為碳源的固體平板篩選，最終得到一株在厭氧條件下可以代謝木糖并積累丁二酸的突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

Escherichia coli strain AFP111 [F+ λrpoS396(Am)rph-1 △(pflAB::Cam)△(ldhA::Kan)△ptsG]，由David P. Clark 教授 (Southern Illinois University)惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 ARTP誘變

利用常壓室溫等離子體育種機(jī) (ARTP)進(jìn)行誘變[9]。以氦氣為氣體，ARTP射頻等離子體的氣體流量為 10 L/min；作用距離 2 mm；作用功率120 W。將培養(yǎng)好的種子用0.85%的生理鹽水稀釋至OD600=1，取10 μL菌液均勻涂布于無菌金屬平板上，利用無菌風(fēng)將菌液吹干；ARTP處理適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，將誘變后的菌體置于裝有1 mL無菌生理鹽水的離心管中；將菌液稀釋 1×104涂布于固體平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

用接種環(huán)從平板上挑取單菌落，接種到裝液量為5 mL LB的血清瓶中，加入2～3 g/L木糖，通入無菌過濾的CO2氣體2 min，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h作為一級(jí)種子。將一級(jí)種子按10%的接種量接種到裝液量為30 mL M9培養(yǎng)基的血清瓶中，加入20 g/L木糖，通入無菌過濾的CO2氣體2 min，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h。

1.2.3 分析方法和酶活分析

細(xì)胞生長用紫外可見分光光度計(jì)于波長600 nm處測定吸光度值。有機(jī)酸、木糖用高效液相色譜法 (HPLC)檢測[10]。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC)酶活的測定方法見參考文獻(xiàn)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死率曲線

由圖1可以看出，等離子體對AFP111的殺傷力比較強(qiáng)，ARTP處理6 s會(huì)殺死80%的菌體；處理10 s以后致死率達(dá)到90%以上；處理30 s致死率達(dá)到100%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)存活率為1%～10%時(shí)，外界處理對細(xì)胞的誘變效應(yīng)較強(qiáng)[12-13]，本實(shí)驗(yàn)選取15 s對細(xì)胞進(jìn)行處理。

2.2 厭氧菌株的選育

以平板上菌落的大小作為初選條件，并輔以HPLC精確檢測突變菌株產(chǎn)酸性能，最后篩選到4株性能良好的菌株，將此 4株菌進(jìn)行厭氧搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，其發(fā)酵結(jié)果見表1。

由表 1可以看出，在厭氧條件下，出發(fā)菌株根本無法代謝木糖，而突變株可以在厭氧條件代謝木糖并積累丁二酸，其中突變株DC111生長及產(chǎn)酸的性能最好，發(fā)酵 72 h菌體 OD600達(dá)到了2.26，丁二酸產(chǎn)量為 6.46 g/L，丁二酸得率為0.78 mol/mol，并且其在厭氧條件下的生長和耗糖曲線，如圖2所示。

圖1 大腸桿菌AFP111的致死率曲線Fig. 1 Variaton of the lethal rate of AFP111 with the ARTP treatment time.

2.3 PCK和PPC酶活測定

在 AFP111厭氧發(fā)酵途徑中, 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 (PCK)皆可催化由磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)到草酰乙酸 (OAA)的反應(yīng)[14]。而由PCK催化的反應(yīng)伴有ATP的生成[15-16]，對突變株和出發(fā)菌株的PPC和PCK比酶活測定，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，突變株DC111中的PCK的比酶活提高了19.33倍，而PPC的比酶活降低了2.32倍。因此，在 DC111中，PEP轉(zhuǎn)化為 OAA的反應(yīng)PCK起到了主導(dǎo)作用，而在PCK催化過程中伴有1 molATP的生成[7]，從而使DC111在厭氧條件下能夠有足夠的ATP供給來代謝木糖并積累丁二酸。

表1 AFP111和突變株純厭氧發(fā)酵性能比較Table 1 Comparation between AFP111 and the mutants

圖2 DC111的生長和耗糖曲線Fig. 2 Anaerobic growth and xylose consumption of DC111.

表2 DC111和AFP111的比酶活Table 2 Specific activities of PPC and PCK in crude extractsof the strain DC111 and AFP111

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