Xinhe Shan 翟云燕 吳金洋 柯傳奎*

（1.chapman parkway ,stonybrook, NY, US. 11790；2.杭州柯氏生物科技有限公司，浙江 杭州 310053）

中國兩千年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》將靈芝按菌蓋和菌柄的顏色（赤、黑、青、白、黃、紫）分類，統(tǒng)稱“六芝”，并記載各自的功效。中國明朝太醫(yī)院·劉文泰等纂修的《本草品匯精要》[1]記載靈芝有赤芝、黒芝、青芝、白芝、黃芝、紫芝。它們的產(chǎn)地、中藥的“性”、功效與主治的疾病見表1。

表1 六芝的產(chǎn)地、中藥的性、功效與主治

記載“六芝”的共同功效為“久服輕身，不老延年，神仙”[1]。根據(jù)中醫(yī)藥理論對(duì)各種靈芝的“功能主治”分析，“六芝”涉及到中醫(yī)的歸經(jīng)：心、肝、脾、肺、腎，而黒芝和紫芝都是以歸腎經(jīng)為主。提示：不同產(chǎn)地、不同品種的“靈芝”可能有不同的生理效應(yīng)。

當(dāng)今對(duì)“六芝”的具體生物物種說法不一，菌類分類專家趙繼鼎[2]對(duì)“六芝”經(jīng)初步考證認(rèn)為：赤芝是靈芝屬的靈芝（Ganoderma lucidum）；紫芝是靈芝屬的紫芝（Ganoderma sinense）；黃芝可能是硫磺菌（Laetiporus Sulphureus）；白芝可能是苦白蹄（Fomitopsis officinalis）；黑芝可能是靈芝科假芝屬的種類，尤以假芝（Amauroderma Sugosum）最相似，也可能是多孔菌屬的黑柄多孔菌（Polyporus Melanopus）；青芝可能是云芝（Coriolus versicolor）。

中華人民共和國藥典（2010年一部）在靈芝項(xiàng)下只指赤芝（Ganoderma lucidum）或紫芝（G. sinense）的干燥子實(shí)體[3]。但是在中國文獻(xiàn)和市場(chǎng)上的“靈芝”可能涉及到靈芝科（Ganodermataceae）和多孔菌科（Polyporaceae）的許多個(gè)屬和種，往往沒有注明拉丁種名。雖然，有實(shí)驗(yàn)報(bào)告[4]表明，赤芝主要通過靈芝三萜成分阻斷I、II型5α-還原酶，而靈芝醇B可以和雙氫睪酮受體結(jié)合。并且指出靈芝的乙醇及甲醇提取物均能顯著地抑制睪酮誘導(dǎo)的 BPH大鼠的腹側(cè)前列腺的增長。但文中忽視了生物學(xué)分類中數(shù)以百計(jì)的靈芝科和多孔菌科物種及產(chǎn)地對(duì)其乙醇及甲醇提取物含量、成分組成，尤其是忽視了給藥量對(duì)藥效的影響。所以，中醫(yī)臨床常用靈芝配伍的處方，由于藥材來源問題，臨床療效不穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞培養(yǎng)人激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株（LN-CaP）和肺腺癌細(xì)胞株（A549），在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的各種靈芝的水提取液或不同濃度的丙酸睪酮，實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞生長曲線，重點(diǎn)分析各種樣品對(duì)以上細(xì)胞株的生理效應(yīng)，探討樣品給藥量與其效應(yīng)的關(guān)系。

1 材 料

（1）不同靈芝樣品的形態(tài)記錄見表2。

（2）細(xì)胞株、試劑和實(shí)驗(yàn)儀器。前列腺癌細(xì)胞株為人激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株（LN-CaP），由北大紹興生物中心贈(zèng)送；肺腺癌細(xì)胞株A549購于美國ATCC。其他試劑和實(shí)驗(yàn)儀器有：RPMI1640培養(yǎng)基（美國Hyclone），0.25%TRYPSIN（美國Hyclone），胎牛血清（美國Hyclone），丙酸睪酮（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)121201），無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），培養(yǎng)皿（上海圣納堡生物科技開發(fā)有限公司），培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific），倒置顯微鏡（日本 OLYMPUS），xCELLigence和 96 孔微電子細(xì)胞芯片由艾森（杭州）生物有限公司生產(chǎn)[7]，離心機(jī)1（上海HealForce），離心機(jī)2（德國Eppendorf），水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），超聲機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司），金屬?。ê贾輮W盛儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 靈芝樣品的水提

將樣品切碎為直徑0.5 cm 大小，置60 ℃烘箱中烘干至恒重。用打粉機(jī)將樣品粉碎成50～200目的粉末。參照《中國人民共和國藥典》2010年版一部（P175）靈芝用量6～12 g[3]的中間值9 g，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液中含藥量按照《藥典》中人體用藥的千分之一（9 mg·mL-1）。稱取1.296g樣品，放入15 mL離心管，加入9 mL純水，旋渦振蕩器混勻，冷水浸泡30 min。超聲機(jī)超聲處理5 min；置水浴鍋，99.9℃水浴1 h；超聲10 min，5 000 rpm離心15 min；再用高速離心機(jī)，10 000 rpm離心10 min；每個(gè)樣品吸取上清液2 mL，用金屬浴99.9 ℃濃縮至500 μl，4℃保存。實(shí)驗(yàn)前先做不同給藥濃度的梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇最佳給藥濃度做正式實(shí)驗(yàn)。

2.2 丙酸睪酮的配制

市售原注射液濃度 25 mg·mL-1，用細(xì)胞生長培養(yǎng)基和無水乙醇配制成 0.25 mg·mL-1～2.5×10-6mg·mL-1，其中無水乙醇濃度為1.6%。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)取配制好的不同濃度丙酸睪酮10μl，加入到150μl細(xì)胞培養(yǎng)液中，使丙酸睪酮的終濃度為 1.5×10-9～1.5×10-3mg·mL-1。

2.3 xCELLigence系統(tǒng)檢測(cè)不同樣品細(xì)胞圖譜

采用xCELLigene系統(tǒng)96 孔微電子細(xì)胞芯片[7]，加入細(xì)胞生長培養(yǎng)基，50μl /孔，將96 孔微電子細(xì)胞芯片放到 xCELLigence系統(tǒng)上測(cè)基線。用胰酶消化細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，配制細(xì)胞濃度，每個(gè)孔接種100 μl細(xì)胞懸液，LN-CaP細(xì)胞接種密度為每孔2×104個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)48 h后加入“靈芝”樣品，使樣品提取液終濃度為 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，120 mg·mL-1，150 mg·mL-1。丙酸睪酮終濃度為1.5×10-9～1.5×10-3mg·mL-1（無水乙醇終濃度為0.1%），對(duì)照組不加藥物，陰性對(duì)照只加0.1%無水乙醇。A549細(xì)胞每孔接種密度6 000個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)20 h后加入不同體積樣品提取液，使細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的終濃度為 20 mg·mL-1，40 mg·mL-1，80 mg·mL-1，100 mg·mL-1，120 mg·mL-1，對(duì)照組 Ctr不加藥物。各種樣品加入到受試細(xì)胞后通過xCELLigene系統(tǒng)來測(cè)量細(xì)胞狀態(tài)的改變，包括細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞粘附、細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)等。數(shù)據(jù)分析使用 RTCA 軟件，對(duì)每孔的數(shù)據(jù)在樣品添加前時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。將檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Microsoft Excel，進(jìn)行后續(xù)處理。通過xCELLigence 系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)可獲取動(dòng)態(tài)細(xì)胞效應(yīng)曲線（細(xì)胞圖譜）[8,9,10]。（說明：人肺腺癌細(xì)胞株A549生長較快，選擇培養(yǎng)20 h后加藥。人激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LN-CaP細(xì)胞倍增時(shí)間長，生長緩慢，選擇培養(yǎng)48 h后加藥。）

表2 不同靈芝樣品的產(chǎn)地和形態(tài)記錄

3 結(jié) 果

3.1 不同濃度靈芝樣品的LN-CaP細(xì)胞圖譜

將1#～9#靈芝樣品按上述操作方法，為便于比較，將每條曲線合并到一個(gè)坐標(biāo)圖內(nèi)。不同濃度的樣品作用于 LN-CaP 的細(xì)胞生長圖譜見圖 1、圖 2：樣品 1#～9#在 2.5、5.0、10 mg·mL-1，1#～8#在 2.5～10 mg·mL-1對(duì)LN-CaP細(xì)胞作用不明顯(圖1 A～C）；唯有樣品9#在2.5～10 mg·mL-1對(duì)LN-CaP細(xì)胞呈與眾不同的生長曲線，即對(duì)LN-CaP細(xì)胞生長抑制呈濃度梯度依賴(圖1 D）。

將樣品1#～8#的濃度加大到120、150 mg·mL-1，顯示抑制LN-CaP細(xì)胞生長且具有差異（圖2）。

3.2 不同濃度靈芝樣品的A549細(xì)胞圖譜

1#～8#靈芝樣品不同濃度對(duì)A549細(xì)胞生長的影響見圖3（A-H），樣品質(zhì)量濃度大于40 mg·mL-1時(shí)對(duì)細(xì)胞生長抑制作用明顯。

圖1 低濃度靈芝樣品的LN-CaP細(xì)胞圖譜

圖2 高濃度靈芝樣品的LN-CaP細(xì)胞圖譜

3.3 不同濃度丙酸睪酮的LN-CaP細(xì)胞圖譜

因?yàn)橐延形恼聢?bào)道[4]抑制睪酮誘導(dǎo)的BPH大鼠的腹側(cè)前列腺的增長，本實(shí)驗(yàn)采用人激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LN-CaP，在觀察不同濃度靈芝作用情況的同時(shí)觀察丙酸睪酮對(duì)LN-CaP細(xì)胞生長的影響（圖4）：陰性對(duì)照0.1%EtOH較對(duì)照Ctr沒有受到明顯影響，丙酸睪酮在較低濃度1.5×10-9、1.5×10-8mg·mL-1時(shí)，刺激 LN-CaP 細(xì)胞增殖；而在較高濃度 1.5×10-7～1.5×10-3mg·mL-1時(shí)，對(duì) LN-CaP 細(xì)胞的生長起抑制作用。

圖3 不同濃度靈芝樣品的A549細(xì)胞圖譜

4 討 論

實(shí)時(shí)細(xì)胞記錄儀器xCELLigence系統(tǒng)[7]通過微電極整合在細(xì)胞培養(yǎng)孔的底部，能自動(dòng)、連續(xù)地監(jiān)測(cè)測(cè)量電阻來反映細(xì)胞生長狀態(tài)，獲取細(xì)胞全過程動(dòng)態(tài)信息。Huiying Fuet[11]使用xCELLigence系統(tǒng)，以三百五十多種中藥材和青藏高原產(chǎn)地采集的十多種冬蟲夏草為例，建立了道地藥材的鑒別方法，推測(cè)中藥材的作用機(jī)理和作用部位（受體），利用非線性的量效關(guān)系判斷有效成分高低，篩選真菌菌種，篩選已知藥物的抑制劑，提出生物物種的演化關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)使用xCELLigence系統(tǒng)，參照以上的鑒別中藥材的方法，得到啟示。

市面上“靈芝”類產(chǎn)品從生物學(xué)分類上看，分別涉及到靈芝科和多孔菌科的屬和種，古文獻(xiàn)早就記載了靈芝的產(chǎn)地、形態(tài)和功效的關(guān)系，而中國藥典只記載多孔菌科（現(xiàn)代分類為靈芝科）靈芝屬的赤芝和紫芝，靈芝項(xiàng)下的“歸經(jīng)”：心、肺、肝、腎。從圖1、2看出，樣品1#～8#在 2.5～10 mg·mL-1加藥量時(shí)抑制作用有差異，但差異不明顯，而在 20～120 mg·mL-1時(shí)，各種“靈芝”呈現(xiàn)出明顯的差異。樣品1#，系云南麗江的野生黑芝，在80 mg·mL-1以上對(duì)人激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LN-CaP有抑制作用；樣品2#～8#，抑制濃度分別為40，80，20，80，40，40，80 mg·mL-1。其中西藏林芝產(chǎn)的赤芝（樣品6#）對(duì)人激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LN-CaP和肺腺癌細(xì)胞株A549作用最強(qiáng)。提示用于治療前列腺疾病的用量按中醫(yī)習(xí)慣用量和藥典用量可能偏低，鑒于在高濃度120 mg·mL-1和150 mg·mL-1時(shí)抑制作用比較明顯，為此，建議中藥處方用量應(yīng)該增加到20～40 g·d-1以上，而且需要考慮靈芝的產(chǎn)地和品種。

圖4 不同濃度的丙酸睪酮對(duì)LN-CaP細(xì)胞生長圖譜

從圖3看出，丙酸睪酮對(duì)人激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LN-CaP有生理效應(yīng)，在濃度小于1.5×10-7mg·mL-1時(shí)有促進(jìn)作用，而大于1.5×10-5mg·mL-1有抑制作用，而且呈非線性的量效關(guān)系。前列腺癌較多發(fā)生在老年男性而不在青壯年，可能是青壯年時(shí)期體內(nèi)的雄激素濃度較高，對(duì)前列腺癌的發(fā)生起抑制作用；而老年時(shí)期的雄激素濃度下降，可能會(huì)對(duì)前列腺癌的發(fā)生起促進(jìn)作用，因此，前列腺癌的發(fā)病率反而增加。這與老年男性因雄性激素分泌下降導(dǎo)致前列腺肥大的現(xiàn)象一致。提示常用促進(jìn)雄性激素分泌的中藥“補(bǔ)腎藥”，可能對(duì)預(yù)防前列腺肥大或前列腺癌有益。

從圖1發(fā)現(xiàn)樣品9#（吉林產(chǎn)的樺褐孔菌）在2.5 mg·mL-1低濃度時(shí)顯示出與眾不同的細(xì)胞圖譜，圖1-D顯示2.5～10 mg·mL-1的非線性抑制關(guān)系，這是否提示：樺褐孔菌對(duì)人激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LN-CaP的生理活性高于靈芝樣品1#～8#，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

以上實(shí)驗(yàn)提示，來自不同產(chǎn)地的靈芝，可能存在真菌生理菌種不同，而導(dǎo)致臨床作用的強(qiáng)度不同，認(rèn)為有必要用以上方法選擇菌種，以使產(chǎn)業(yè)化后的產(chǎn)品穩(wěn)定有效。

美國編著者凱西麗醫(yī)生談中草藥保健品及流行療法的中文版《傳聞與真相1》[12]第188頁“科研證據(jù)”項(xiàng)下記載，“緩解下泌尿道癥狀：88位男性，有輕度到中度泌尿道癥狀，被給予一種靈芝提取物（每天6毫克）或安慰劑，為期12周。相比安慰劑，靈芝提取物較大幅度改善下泌尿道癥狀，也沒有不良反應(yīng)的報(bào)告”。這個(gè)信息說明，靈芝有可能是一種副作用小且能治療下泌尿道癥狀疾病的中草藥。遺憾的是，以上記載也沒有注明靈芝的產(chǎn)地、種名和靈芝提取物的得率。

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[12] 凱西麗（美）等主編, 劉愛民等翻譯. 傳聞和真相1[M]. 江蘇科學(xué)技術(shù)出版社, 2012, 9： 188.