王力剛, 朱 娟, 王 猛, 唐順明, 2, 沈興家, 2

(1.江蘇科技大學(xué), 江蘇 鎮(zhèn)江 212018)(2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所 農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點實驗室,江蘇 鎮(zhèn)江 212018)

家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲和模式生物,家蠶滯育機理研究一直受到學(xué)界的關(guān)注并取得了重要進展[1-3].根據(jù)自然條件下1年內(nèi)發(fā)生的世代數(shù)可將家蠶分為一化性(univoltinism)、二化性(bivoltinism)和多化性品種(polyvoltinism).不同化性的家蠶發(fā)生滯育的情況也不同,家蠶二化性品種的滯育性由遺傳性決定并受上代環(huán)境影響[4-6].滯育激素(DH)在決定家蠶胚胎滯育中有著重要作用[4- 5, 7],胚胎期25 ℃光照處理,至蛹期咽下神經(jīng)節(jié)(SG)合成和分泌滯育激素DH,成蟲交配后產(chǎn)滯育卵;相反,胚胎期15 ℃暗催青處理,SG合成和分泌的DH少,成蟲交配后產(chǎn)非滯育卵[8].研究表明：家蠶滯育激素受體基因Bmdhr主要在蛹中期卵巢中表達[7],DH必須與滯育激素受體(BmDHR)結(jié)合,通過調(diào)控下游基因的表達變化才能啟動滯育[6, 9].但是,目前人們對Bmdhr表達的調(diào)控機制尚不清楚.

為了深入研究家蠶滯育的分子機理,本實驗根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫公布的Bmdhr上游序列(Bm-scaf 84 | BABH01033472.1)設(shè)計PCR引物,以家蠶二化性品種“秋豐”基因組DNA為模板,克隆了1 395 bp(-1 364 ～+31 nt)和972 bp(-941 ～+31 nt)2個不同長度的Bmdhr啟動子序列,構(gòu)建Bmdhr啟動子驅(qū)動的熒光素酶基因報告載體,利用家蠶細胞瞬時表達分析系統(tǒng)分析其轉(zhuǎn)錄活性和外源昆蟲保幼激素類似物(JHA)、蛻皮激素(20-OH-ecdysone)和滯育激素(DH)對其活性的影響.

1 實驗

1.1 實驗試劑

家蠶二化性品種“秋豐”、宿主菌E.coliTop10、質(zhì)粒載體pMD18T和pGL3.0 basic 載體(含有熒光素酶基因luc)、BmN細胞株由農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點實驗室保存.蛻皮激素20-OH-ecdysone由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所附屬蠶藥廠生產(chǎn)并提供；保幼激素類似物(JHA)ZR-515購自Sigma公司；滯育激素(MW:2731.01)由上海強耀生物科技有限公司合成.各種限制性內(nèi)切酶、Taq酶、T4 DNA連接酶、Proteinase K等主要試劑購自TaKaRa(大連)有限公司.TC-100昆蟲細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、lipofectin試劑購自Invitrogen公司.熒光素酶檢測試劑盒(E4030)購自Promega公司.核苷酸引物的合成、測序委托上海生工生物有限工程公司完成.

1.2 家蠶基因組DNA的提取

取家蠶品種秋豐5齡第3日幼蟲后部絲腺,參照文獻[10]的方法提取家蠶基因組DNA,經(jīng)濃度和純度檢測后,-20℃保存?zhèn)溆?

1.3 啟動子序列擴增

根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫公布的Bmdhr序列(Bm-scaf 84 | BABH01033472.1),使用Oligo 6軟件分別在-1 400 bp和-1 000 bp左右設(shè)計上游引物,在+10 bp處設(shè)計下游引物,并分別導(dǎo)入KpnⅠ和BglⅡ酶切位點(下劃線部分):F1 5′-GGTACCCGTCGGACTTGTCGGATCT-3′,F2 5′-GGTACCGTGTTGAAGTG CATGGACGA-3′,R 5′-AGATCTGACCAGCCCTCTCGACTACATT-3′.

以家蠶基因組DNA為模板,進行PCR擴增,擴增條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃、45 s，60℃、1 min，72℃、2 min,25個循環(huán)后72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定和分離,用DNA回收試劑盒純化后克隆到pMD18-T載體中,進行測序驗證.

1.4 載體構(gòu)建

將測序正確的質(zhì)粒使用KpnⅠ-BglⅡ內(nèi)切酶雙酶切后電泳,分離純化獲得不同長度的Bmdhr基因啟動子片段,在T4 DNA連接酶作用下克隆到經(jīng)同樣酶消化的pGL3.0 Basic載體中,轉(zhuǎn)化E.coliTop10,篩選出重組質(zhì)粒pGL-Bmdhr1364-luc、pGL-Bmdhr941-luc,并進行酶切鑒定.

1.5 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與瞬時表達

家蠶細胞系BmN參照文獻[11]的方法進行細胞培養(yǎng)傳代.細胞用24孔板培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)染前去除培養(yǎng)基并用無血清培養(yǎng)基洗滌2次,將100 μL含有5 μL脂質(zhì)體和1 μg報告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染液與1 mL無血清TC-100培養(yǎng)基混勻,溫育細胞4～5 h,除去舊培養(yǎng)基,加入300 μL含有10% FBS的TC-100培養(yǎng)基,激素處理組更換培養(yǎng)基時加入不同濃度ZR515、β-蛻皮激素和DH,對照組加等體積ddH2O,以pGL3.0 basic轉(zhuǎn)染的細胞為空白對照,每組實驗重復(fù)3次.

1.6 熒光素酶分析

細胞轉(zhuǎn)染72 h后,4℃ 5 000 r/min離心5 min收集細胞,去上清液,按照E4030試劑盒(promega)的說明裂解細胞.加100 μL熒光素酶底物于測定管中,然后加入20 μL的細胞裂解液并混勻,在LuminoMeter 20/20熒光光度計上測定熒光素酶(LUC)活性(2 s延遲，10 s讀數(shù)),以相對熒光強度單位(relative luminescence unit,RLU)表示[12].平行測定細胞總蛋白濃度,以校正報告質(zhì)粒的熒光素酶活性值[13].使用SPSS軟件進行差異性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同長度Bmdhr啟動子活性比較

經(jīng)M13引物雙向測序后,分別得到長度為1 395 bp和972 bp的片段.2個啟動子片段分別包含1 364 bp和941 bp的5’上游序列,以及31 bp的第1外顯子部分序列.比對結(jié)果表明：克隆的片段與公布的Bm-scaf 84 | BABH01033472.1序列一致,說明已成功克隆到Bmdhr啟動子片段.

將構(gòu)建好的報告質(zhì)粒pGL-Bmdhr1364-luc、pGL-Bmdhr941-luc和pGL3.0 basic質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BmN細胞,轉(zhuǎn)染4～5 h后使用完全培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后收集細胞,檢測LUC活性,并經(jīng)空載體和總蛋白量矯正,結(jié)果見表1.從表中可看出，Bmdhr-941啟動子活性明顯高于Bmdhr-1364啟動子,前者是后者的2.1倍,這表明Bmdhr基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-941～-1 364 nt區(qū)域可能存在負調(diào)控元件.

表1 不同長度的Bmdhr啟動子活性Table 1 Activities of different length Bmdhr promoter

2.2 JHA對Bmdhr啟動子活性的影響

將構(gòu)建好的報告質(zhì)粒pGL-Bmdhr-1364和pGL3.0 basic質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BmN細胞,轉(zhuǎn)染4～5 h后使用保幼激素類似物(ZR515)濃度為0,1,2,4,6和8 μg/mL的完全培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后檢測LUC活性,并經(jīng)空載體和總蛋白量矯正,結(jié)果見圖1.當(dāng)保幼激素類似物濃度為2,4,6 μg/mL時,啟動子的活性極顯著增強(F=2.382,P=0.003<0.01),分別是濃度為0時的2.0,2.1和1.5倍;而當(dāng)保幼激素類似物濃度為1 μg/mL時,啟動子活性顯著減弱(F=0.867,P=0.021<0.05),濃度為8 μg/mL時,啟動子的活性則極顯著減弱(F=0.019,P=0.001<0.01).

圖1 保幼激素類似物對Bmdhr啟動子的活性影響Fig.1 Effects of JHA on Bmdhr promoter activities

2.3 20-OH-ecdysone對Bmdhr啟動子活性的影響

將構(gòu)建好的報告質(zhì)粒pGL-Bmdhr-1364和pGL3.0 basic質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BmN細胞,轉(zhuǎn)染4～5 h后使用β-蛻皮激素濃度為0,1,2,4,6,8和10 μg/mL的完全培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后檢測LUC活性,并經(jīng)空載體和總蛋白量矯正，結(jié)果見圖2.當(dāng)β-蛻皮激素濃度為0時,Bmdhr基因啟動子的活性為677±24.33;當(dāng)β-蛻皮激素濃度為1,2,6,8,10 μg/mL時,啟動子的活性增加極顯著(F=85.831,P=0.001<0.01),分別是濃度為0時的1.8,2.8,1.2,2.2,2.4倍;而濃度為4 μg/mL的條件下,啟動子活性明顯減弱(F=28.012,P=0.013<0.05),僅是濃度為0 μg/mL時的80%.

圖2 20-OH-ecdysone對Bmdhr啟動子的活性影響Fig.2 Effects of 20-OH-ecdysone on Bmdhr promoter activities

2.4 滯育激素對Bmdhr啟動子活性的影響

將構(gòu)建好的報告質(zhì)粒pGL-Bmdhr-1364和pGL3.0 basic質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BmN細胞,轉(zhuǎn)染4～5 h后用滯育激素濃度為0做對照,10,20,40,60,80和100 nM的完全培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后收集細胞,檢測LUC活性,并經(jīng)空載體和總蛋白量矯正,結(jié)果見圖3,當(dāng)滯育激素濃度為10,20,40 nM時,啟動子的活性顯著增強(F=9.442,P=0.037<0.05),分別是濃度為0的1.7，2.3和1.5倍;而當(dāng)滯育激素濃度為60，80和100 nM時,啟動子活性變化不顯著(F=0.491,P=0.522>0.05).

圖3 滯育激素對Bmdhr啟動子的活性影響Fig.3 Effects of DH on Bmdhr promoter activities

3 討論

家蠶滯育激素受體基因的表達具有時空特異性,它與家蠶滯育密切相關(guān)[6].本實驗克隆了2個不同長度的Bmdhr啟動子片段,經(jīng)對體外細胞瞬時表達分析,Bmdhr基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1 364～-941 nt區(qū)間存在負調(diào)控元件.在線軟件(http://alggen.lsi.upc.es/recerca/menu-recerca.html)和DNAstar軟件分析顯示,1 364 bp的Bmdhr啟動子片段包含啟動子基本元件如TATA box、GATA box,還有多個上游調(diào)控元件,如EcREs (PuG(G/T)TCA)、En(engrailed)元件、Zeste元件、AntP元件和DPE元件,其中-1 364～-941 nt之間存在2個EcRE元件、1個En元件和1個AntP元件.En元件對果蠅某些基因在轉(zhuǎn)錄水平有抑制作用[14],由此可推測En元件對Bmdhr基因的表達也有抑制作用,但這還需進一步實驗證實.

在家蠶發(fā)育過程中,蛻皮激素單獨作用能引起幼蟲到蛹的變態(tài)[15].蛹期初期,在家蠶正常雌蛹血淋巴中蛻皮激素的濃度急驟增加[16],并且Bmdhr在此時的轉(zhuǎn)錄水平急速上升[6, 17],這說明蛻皮激素可能會增強Bmdhr啟動子的活性.但是,當(dāng)20-OH-ecdysone為4 μg/mL時,Bmdhr啟動子的活性不但沒有增強反而呈下降趨勢,其原因則有待進一步地深入研究.

DH對Bmdhr啟動子活性的影響同樣具有劑量效應(yīng),其濃度在10～40 nM時,可顯著增強啟動子活性;當(dāng)濃度達到60 nM時,啟動子活性變化不顯著.這種劑量效應(yīng)與滯育激素對海藻糖酶基因啟動子調(diào)控作用[18]是吻合的.

本研究結(jié)果為探索Bmdhr基因的表達調(diào)控和闡明家蠶滯育的分子機理積累了實驗數(shù)據(jù).但是,家蠶體內(nèi)Bmdhr基因的真實表達調(diào)控情況,還需要在個體水平加以深入研究才能揭示.

[1] 黃君霆. 家蠶滯育分子機制的研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué),2003,29(1):1-6.

Huang Junting. Studies on the molecular mechanism of diapause in the silkworm,Bombyxmori[J].ActaSericologicaSinica,2003, 29(1): 1-6.(in Chinese)

[2] 徐衛(wèi)華. 昆蟲滯育研究進展[J]. 昆蟲知識, 2008, 45(4):512-517.

Xu Weihua. Advances in insect diapause [J].ChineseBulletinofEntomology,2008, 45(4): 512-517.(in Chinese)

[3] 顧燕燕, 華榮勝, 周耐明,等. 家蠶滯育激素受體基因 (Bmdhr) 的分子克隆及定量分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2008, 34(3):417-423.

Gu Yanyan, Hua Rongsheng, Zhou Naiming, et al. Cloning and quantitative analysis of diapause hormone receptor gene in the silkworm, Bombyx mori[J].ActaSericologicaSinica,2008, 34(3): 417-423.(in Chinese)

[4] Fukuda S. Function of the pupal brain and suboesophageal ganglion in the production of non-diapause and diapause eggs in the silkworm [J].AnnotationesZoologicaeJaponenses，1952, 25(1): 149-155.(in Japanese)

[5] Hasegawa K. The diapause hormone of the silkworm, Bombyx mori[J].Nature,1957, 179(4375):1300-1301.

[6] Homma T, Watanabe K, Tsurumaru S, et al. G protein-coupled receptor for diapause hormone, an inducer of Bombyx embryonic diapause[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2006, 344(1): 386-393.

[7] Kitagawa N, Shiomi K, Imai K, et al. Establishment of a sandwich ELISA system to detect diapause hormone, and developmental profile of hormone levels in egg and subesophageal ganglion of the silkworm, Bombyx mori[J].ZoologicalScience,2005, 22(2): 213-221.

[8] Fukuda S. The production of the diapause eggs by transplanting the suboesophageal ganglion in the silkworm[J].ProceedingsoftheJapanAcademy, 1951, 27: 672-677.

[9] Yamashita O, Hasegawa K and Seki M. Effect of the diapause hormone on trehalase activity in pupal ovaries of the silkworm, Bombyx mori L[J].GenCompEndocrinol,1972, 18(3): 515-23.

[10] Blin N，Stafford D W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes[J].NucleicAcidsResearch, 976, 3: 2303-2308.

[11] Summers M D,Smith G E. A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures [M].USA：Bulletin B-Texas Agricultural Experiment Station,1987,1555:10-18, 38-46.

[12] Zhao Qiaoling,Shen Xingjia,Zhu Liangjun, et al. Characterization of CIb1 gene promoter from silkworm,Bombyxmori[J].ZeitschriftfurNaturforschung, 2007, 62c:875-880.

[13] Zhou Y J, Xiao Q L, Zhang Z F, et al. Foreign insect hormones stimulating the transcription of the ie-1 promoter of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus in vivo and in vitro[J].Bioscience,biotechnology,andbiochemistry,2002, 66: 1488-1494.

[14] Smith S T,Jaynes J B. A conserved region of engrailed, shared among all en-, gsc-, Nκ1-, Nκ2-and msh-class homeoproteins, mediates active transcriptional repression invivo[J].Development, 1996, 122: 3141-3150.

[15] 呂鴻聲. 中國養(yǎng)蠶學(xué)[M].上海：上?？萍汲霭嫔? 1991: 518-522.

[16] 張劍韻, 黃龍全. 桑蠶蛹期以昆蟲激素類物質(zhì) MH, JHA, CA3 處理后卵巢增重曲線比較[J]. 蠶桑通報,1994,25(1):26-28.

Zhang Jianyun, Huang Longquan. Comparison of weight increasing curves ofBombyxmoripupa ovary after treatment of insect hormone moulting hormone, juvenile hormone analog and Imidazole compounds CA3[J].BulletinofSericulture,1994, 25(1): 26-28 (in Chinese)

[17] 王力剛,宋海韜,黃勇,等. 催青溫度對家蠶二化性品種滯育激素受體基因表達的影響及基因的結(jié)構(gòu)特征[J]. 蠶業(yè)科學(xué),2011,37(2):215-223.

Wang Ligang,Song Haitao,Huang Yong,et al.Influence of incubation temperature on expression of diapause hormone receptor genes in bivoltineBombyxmorivariety and structural features of the gene [J].ActaSericologicaSinica,2011,37(2):215-223 (in Chinese)

[18] 沈興家,唐順明,易詠竹,等. 家蠶、野桑蠶海藻糖酶基因啟動子的特性及其滯育激素的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[J]. 蠶業(yè)科學(xué),2004,30(2):147-150.

Shen Xingjia, Tang Shunming, Yi Yongzhu, et al. Characterization of trehalase gene promoters from silkworm,BombyxmoriandBombyxmandarinaand transcriptional regulatory effects of diapause hormone on them[J].ActaSericologicaSinica, 2004, 30(2):147-150 (in Chinese)