聶瑞紅，呂利華，魏國琴，王桂琴，趙良啟*

(1山西大學化學生物學與分子工程教育部重點實驗室， 太原030006;2山西晉城無煙煤礦業(yè)集團有限公司;3山西醫(yī)科大學微生物學與免疫學教研室;*通訊作者，E-mail:liangqi@sxu.edu.cn)

生物多糖，不僅是生物機體結構的組成成分，而且是一類具有重要生物功能的活性物質［1，2］，在機體生命活動過程中扮演著重要角色，例如信號識別、細胞分化、免疫調節(jié)等。如今，多糖生物學已成為繼核酸、蛋白質生物學研究之后的又一大學科分支。生物多糖的應用研究已取得較大進展，越來越多的功能多糖從動物、植物和微生物中被開發(fā)出來。一些多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等功能，已用于生物醫(yī)藥［3，4］。

目前，在已分離得到的多種生物活性多糖中，有一些多糖已顯示出較好的醫(yī)療功效和應用價值，然而其理化性質和生物活性仍有待改善和提高。改善多糖相關性質的方法有多種，但最為有效的方法是分子修飾。迄今為止，已有羥甲基化、硫酸酯化、硒化、羧甲基化等方法應用于多糖修飾，在改善多糖理化性質和生物活性方面取得了一定進展［5］。

我們實驗室已經應用微波輻照氧化技術降解Rhizobium sp.N613(REPS)獲得了一種小分子Rhizobium sp.N613(LREPS)［6－8］，極大地改善了原多糖的溶解性。本文擬以乙醇為溶劑，應用一氯乙酸對LREPS進行羧甲基化修飾，通過正交試驗優(yōu)化羧甲基化LREPS(CM-LREPS)的制備工藝條件。選用不同取代度的CM-LREPS進行抗腫瘤活性測定，以取代度和抑瘤率為檢測指標確定CM-LREPS的最佳制備工藝條件，為CM-LREPS的開發(fā)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LREPS，由本實驗室發(fā)酵純化降解制得，純度達99%以上，分子量為10.352 kD。一氯乙酸、氫氧化鈉、冰醋酸、無水乙醇、溴化鉀，以上試劑均為分析純，均購自天津化學試劑三廠。

1.2 主要儀器

pH計 (德國inolab公司)，CR22G高速冷凍離心機(日本日立公司)，Heto-PL3000－冷凍干燥機(捷克熱力電器公司)，傅立葉變換紅外光譜儀 (美國Mattson公司)。

1.3 試驗動物與腫瘤細胞株

健康昆明種小鼠，4－5周齡，購于山西醫(yī)科大學實驗動物中心。小鼠肝癌腹水瘤H22細胞株購于山西省腫瘤醫(yī)院實驗動物中心。

1.4 試驗方法

1.4.1 CM-LREPS 制備及工藝條件優(yōu)化 CMLREPS制備方法:乙醇為溶劑，按一定的物料比，將乙醇、一氯乙酸、氫氧化鈉及LREPS分別加入反應器中，充分攪勻后移入恒溫水浴振蕩器中，待物料升溫至反應溫度，保溫進行反應。反應完成后加入冰醋酸，中和pH為7.0。先以自來水透析再以蒸餾水透析，加入3倍體積乙醇沉淀，離心棄上清，冷凍干燥法獲得一系列CM-LREPS產物。

CM-LREPS分子結構測定:LREPS與 CMLREPS的結構比較采用溴化鉀壓片法，分別稱取5 mg LREPS和CM-LREPS，與400 mg KBr粉末混合研磨、壓片，采用紅外光譜儀掃描分析，掃描范圍為4 000－500/cm。

取代度(DS)和CM-LREPS取代度的測定:取代度指平均每個失水葡萄糖單元上被反應試劑取代的羥基數目。CM-LREPS取代度的測定采用硫酸銅沉淀法［9］。

正交試驗優(yōu)化CM-LREPS制備條件:在單因素實驗基礎上，選取乙醇體積分數、LREPS用量、一氯乙酸用量、氫氧化鈉用量、醚化溫度及時間為因素，采用L25(56)正交表優(yōu)化CM-LREPS制備條件，因素水平設計見表1。

表1 CM-LREPS正交試驗設計因素水平表Tab 1 Factors and levels of orthogonal test for CM-LREPS

1.4.2 CM-LREPS生物學活性測定及最佳制備工藝確定 不同取代度CM-LREPS的抗腫瘤及免疫活性測定:供試昆明種雌性小鼠隨機分組，每組10只。抽取接種1周左右的小鼠肝癌腹水瘤H22，以生理鹽水配制成106個/ml的腫瘤細胞懸液，在每只小鼠左腋皮下接種0.2 ml，建立荷瘤小鼠模型。接種24 h后，每日1次腹腔注射0.2 ml試樣溶液，不同取代度的CM-LREPS劑量為10 mg/kg體重，陽性對照組環(huán)磷酰胺(Cy)的劑量為20 mg/kg體重，陰性對照組注射生理鹽水，連續(xù)給藥10 d，每日定時稱重小鼠體重并記錄。連續(xù)給藥10d停藥，次日稱量小鼠體重斷頸處死，摘取小鼠脾臟及胸腺，剝取小鼠左腋下瘤塊分別稱量脾臟、胸腺和瘤塊重量并計算平均值［7］。

CM-LREPS最佳制備工藝條件確定:根據正交試驗結果和不同取代度CM-LREPS的抑瘤率，確定CM-LREPS的最佳制備工藝條件。

2 結果與分析

2.1 不同取代度CM-LREPS的制備

應用L25(56)正交表進行了25組實驗并得到一系列取代度不同的CM-LREPS。CM-LREPS試驗結果和方差分析見表2、表3。

表2 CM-LREPS正交試驗結果Tab 2 Orthogonal test results of CM-LREPS

表3 CM-LREPS方差分析Tab 3 Analysis of variance of CM-LREPS

由表2正交試驗結果可以看出，實驗成功獲得了一組不同取代度的羧甲基化LREPS樣品及其相應的制備工藝參數。由表3可以看出，影響LREPS羧甲基化的因素順序是:醚化溫度＞乙醇質量分數＞一氯乙酸用量＞LREPS用量＞氫氧化鈉用量＞反應時間。通過調整醚化溫度，乙醇質量分數及其一氯乙酸用量，能夠有效改變CM-LREPS的取代度。

CM-LREP結構的紅外分析(圖1)顯示，兩種純多糖在4 000－500/cm范圍內有糖類特征吸收峰，3 400/cm附近出現的寬峰是分子內或分子間O－H伸縮振動的結果。CM-LREPS樣品在1 720/cm附近的吸收峰為CCA羧基形成的酯鍵 (－COOR)C=O的伸縮振動。1 636/cm的強吸收峰為羧酸鹽(－COO－)的不對稱伸縮振動，同時也是糖水化物樣品的特征吸收峰［10］。綜上所述，經羧甲基修飾后，LREPS結構發(fā)生了變化。

2.2 CM-LREPS生物學活性測定及最佳制備工藝確定

以 LREPS 和CM-LREPS(DS=0.285、0.531、0.659和0.899)代表性樣品進行體內鼠肝癌H22抗腫瘤和免疫活性試驗，結果見表4。

從表4可以看出，取代度的大小與抑瘤率有著直接關系，不同的取代度抑瘤作用不相同。取代度最低組 (DS=0.285)和取代度中等組 (DS=0.531和DS=0.659)的抑瘤率較修飾前LREPS都有所提高，其中取代度為0.659的CM-LREPS抑瘤率最高，達到59.2%。而當取代度達到0.899時，其抗腫瘤活性降低到49.2%?？梢奀M-LREPS對H22腫瘤細胞抑制作用有其最適的取代度取值范圍。陽性對照組(環(huán)磷酰胺)抑瘤效果最為明顯，但是顯著降低了小鼠的胸腺與脾臟指數，對小鼠產生了毒副作用。而LREPS及CM-LREPS可顯著增加小鼠胸腺，脾臟的重量，增強了荷瘤小鼠的免疫功能。本實驗中綜合考察了不同取代度CM-LREPS對小鼠肝癌H22抑瘤率及臟器指數的影響，療效最好的CM-LREPS取代度在0.659左右。

圖1 CM-LREPS與LREPS紅外圖譜比較Fig 1 Comparison of infrared spectra between CM-LREPS and LREPS

表4 CM-LREPS和LREPS對H22荷瘤小鼠瘤重及臟器指數的影響Tab 4 Antitumor activity，thymus and spleen index of CM-LREPS and LREPSagainst H22

以羧甲基化LREPS的取代度及抗腫瘤活性為檢測指標，確定CM-LREPS的最佳制備工藝條件:乙醇質量分數為90%，LREPS用量為2.0 g，一氯乙酸用量為3.0 g，氫氧化鈉用量為4.0 g，醚化溫度為40℃，反應時間為4 h。

3 討論

本文以實驗室開發(fā)的小分子量錦雞兒根瘤菌多糖LREPS為基本原料，一氯乙酸為修飾劑，通過改變底物加量、反應體系酸堿度、醚化溫度和反應時間等條件，制備羧甲基化小分子多糖—CM-LREPS。紅外光譜分析表明實現了LREPS的羧甲基化。通過正交試驗考察了乙醇質量分數、LREPS、一氯乙酸、氫氧化鈉用量、醚化溫度及時間對CM-LREPS取代度的影響并在獲得一系列CM-LREPS產物的同時建立了CM-LREPS的制備工藝。本試驗中羧甲基化反應時間短，反應副產物少，無有毒副產物生成，反應過程簡單。在實驗中我們發(fā)現，通過調整醚化溫度、乙醇質量分數、一氯乙酸可以顯著影響CMLREPS的取代度，而LREPS用量、氫氧化鈉用量及反應時間對CM-LREPS的取代度影響較小。

以取代度和抗腫瘤活性為指標，進一步確定了CM-LREPS的最佳制備工藝條件。本文為今后羧甲基化多糖在保健或藥物開發(fā)方面提供了一定的參考價值，CM-LREPS的抗腫瘤作用機制有待進一步研究。

［1］Huheihel M，Ishanu V，Tal J，etal.Activity of Porphyridium sp.polysaccharide against herpes simplex viruses in vitro and in vivo［J］.Biochem Biophys Methods，2002，50(223):189－200.

［2］Chen XM，Zhang J，Tian GY.Studies on synthesis and antitumor activity of phosphorylated Achyranthes bidentata polysaccharide(P-AbPS)［J］.Chin J Chem，2002，20(11):1406－1410.

［3］Umemura K，Yanase K，Suzuki M，etal.Inhibition of DNA topoisomerases I and II，and growth inhibition of human cancer cell lines by a marine microalgal polysaccharide［J］.Biochem Pharmacol，2003，66:481－487.

［4］Ramesh HP，Tharanathan RN.Carbohydrates—the renewable raw materials of high biotechnological value［J］.Crit Rev Biotechnol，2003，23(2):149－173.

［5］Hanna DK，Michael PM，Bruce JP.Modifications and applications of the Acinetobactervenetianus RAG-1 exopolysaccharide，the emulsancomplex and its component［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，81:201－210.

［6］韓勇，黃曉波，董岳峰，等.根瘤菌N613胞外多糖發(fā)酵條件及抗腫瘤作用研究［J］.微生物學通報，2007，34(5):909－913.

［7］Zhao LQ，Chen YL，Ren S，etal.Studies on the chemical structure and antitumor activity of an exopolysaccharide from Rhizobium sp.N613 ［J］.Carbohydr Res，2010，345(5):637－643.

［8］魏國琴，呂利華，陳艷麗，等.小分子 Rhizobium sp.N613胞外多糖的制備及其抗腫活性［J］.微生物學通報，2011，38(5):743－749.

［9］鄧勇，咼琴.馬鈴薯羧甲基淀粉制備工藝的研究［J］.中國糧油學報，2001，16(1):43－45.

［10］孫元琳，崔武衛(wèi)，顧小紅，等.傅里葉變換紅外光譜法測定當歸果膠多糖的酯化度［J］.光譜學與光譜分析，2009，29(3):682－685.