張銳虎，榮 曼，劉田福

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心， 太原 030001;*通訊作者，E-mail:YKDLTF@yahoo.com)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種兒童常見的實(shí)質(zhì)性腫瘤，大約65%的腫瘤起源于腹部，15%－20%起源于胸部，其余15%起源于頸部、骨盆等。該病中位發(fā)病年齡為22個(gè)月，早期難發(fā)現(xiàn)，易誤診誤治［1］。本實(shí)驗(yàn)通過給不同年齡、不同部位的BALB/c小鼠接種神經(jīng)母細(xì)胞瘤(N2a)細(xì)胞，成功建立了神經(jīng)母細(xì)胞瘤動物移植模型，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞 清潔級BALB/c小鼠，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;N2a細(xì)胞株，購于中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 試劑及儀器 DMEM/F－12培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、PBS、0.25%胰蛋白酶消化液;超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱、75 cm2培養(yǎng)瓶、移液管、吸耳球、酒精燈等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) N2a細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、飽和濕度的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。傳代時(shí)吸盡培養(yǎng)液，加入1－2 ml PBS清洗殘留的培養(yǎng)液，吸棄后加入0.25%胰蛋白酶消化液1－3 ml，均勻鋪滿培養(yǎng)瓶底部。置培養(yǎng)箱中2－5 min，鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)懸浮時(shí)，輕輕拍打培養(yǎng)瓶側(cè)面使細(xì)胞全部懸浮。加入剛吸出的舊培養(yǎng)液終止消化。移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄掉培養(yǎng)液，加入2－3 ml新培養(yǎng)液，將離心產(chǎn)生的沉淀輕輕吹打成細(xì)胞懸液。按1∶2－1∶3的比例分置到培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入完全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)［2］。

1.2.2 注射用細(xì)胞懸液的制備 選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)消化、吹打、加培養(yǎng)液等制成單細(xì)胞懸液。在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)滴加微量(約100μl)細(xì)胞懸液，使細(xì)胞懸液充滿計(jì)數(shù)板和蓋玻片之間的空隙。顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞，根據(jù)公式:濃度=(4個(gè)大格的細(xì)胞總數(shù)/4)×104個(gè)/ml，計(jì)算細(xì)胞懸液的濃度，并通過加減培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml［3］。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動物的準(zhǔn)備及分組 BALB/c小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度22－25℃，相對濕度50%－70%。飼料、墊料經(jīng)120℃高壓消毒20 min，自由采食與飲水，墊料每周更換2次［4］。實(shí)驗(yàn)鼠按出生順序以窩為單位隨機(jī)分為腹腔、頸背、腋下3個(gè)注射組，首次注射在1－7 d進(jìn)行，根據(jù)外觀和觸摸檢查對確定未長瘤的鼠只在8－14 d進(jìn)行再次注射;并對仍確定未長瘤者在15－21 d時(shí)進(jìn)行了第3次注射。

1.2.4 細(xì)胞接種 1－3 d鼠的接種量為0.1 ml/只，剩余年齡段的均為0.2 ml/只。注射時(shí)根據(jù)注射部位，選擇相應(yīng)的體位進(jìn)行抱定。其中進(jìn)行腹腔和腋下注射時(shí)，選擇迎面抱定;進(jìn)行頸背部注射時(shí)，取俯臥位固定，用食指和拇指輕輕提起頸背部的皮膚，在形成的三角區(qū)進(jìn)行注射。70%酒精消毒注射部位，1 ml注射器抽取細(xì)胞懸液，輕柔進(jìn)針，緩慢注射，待注入大半時(shí)，邊退針邊注射。完成后，停留片刻再緩慢拔針，以防注射液外漏［1，5］。

1.2.5 模型鑒定 接種細(xì)胞后次日即開始觀察并觸摸小鼠的接種部位，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有鼓脹或觸摸有異物感時(shí)，即可初步判斷有瘤組織生成，繼續(xù)進(jìn)行觀察，若發(fā)現(xiàn)瘤體逐漸增大即可基本確定，潛伏期按接種之日到初步確認(rèn)的日期計(jì)算［1，6，7］。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)鼠生長曲線的測定 實(shí)驗(yàn)鼠自細(xì)胞接種之日起，每周稱量一次體重。

2 結(jié)果

2.1 動物數(shù)量及存活率

此次共有12窩、53只BALB/c小鼠參與實(shí)驗(yàn)。50只完成實(shí)驗(yàn)的BALB/c小鼠中有雌鼠19只、雄鼠31只，總的存活率為94.34%。21只荷瘤鼠占完成實(shí)驗(yàn)鼠的比例為42%，其中有雌鼠11只、雄鼠10只，各性別實(shí)驗(yàn)鼠的成瘤率為57.89%、32.26%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 不同注射部位成瘤率的比較

從成瘤率來看，腹腔注射的成瘤率最高，達(dá)到了46.15%(見表1)。

表1 不同接種部位成瘤率的比較Tab 1 Comparison of tumor formation rate among different inoculation sites

2.3 不同接種日齡對成瘤率的影響

在三個(gè)年齡段中1－7 d的成瘤率最高，達(dá)48.39%。隨著年齡的增長，鼠只越容易抱定和注射，發(fā)生外溢的現(xiàn)象也隨之減少，但成瘤率卻未見增長(見表2)。

表2 不同年齡接種成功率的比較Tab 2 Comparison of tumor formation rate among different ages

2.4 移植瘤的潛伏期

本實(shí)驗(yàn)中潛伏期最短的為5 d，最長的有31 d，最多的在11－15 d，占荷瘤鼠的比例為61.9%(見表3)。

2.5 荷瘤雌鼠與正常雌鼠生長曲線的比較

實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選取了10只未參與實(shí)驗(yàn)的同齡雌鼠與荷瘤雌鼠一起每周稱重一次，分別繪制生長曲線。通過對各時(shí)間點(diǎn)體重及生長曲線的分析，發(fā)現(xiàn)兩組鼠只在0－3周和7－8周這兩個(gè)時(shí)間段的體重比較吻合，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，而在4－6周及9周以后兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖1可知，從出生到3周，荷瘤鼠與正常鼠的生長曲線基本吻合，說明注射細(xì)胞后，由于潛伏期的存在，對荷瘤鼠的體重增長基本無影響。4－5周荷瘤鼠的體重增長明顯慢于正常鼠，6周體重增長加速，在7－8周接近正常鼠的水平，此后仍以較高的速度增長，并超過正常鼠(見圖1、表4)。

表3 荷瘤鼠的潛伏期分布情況Tab 3 The distribution of incubation period of tumorbearing mice at different incubaton period

圖1 正常鼠與荷瘤鼠的生長曲線Fig 1 Growth curve of normal mice and tumor－bearing mice

表4 各組在不同時(shí)間點(diǎn)體重的變化Tab 4 Changes of body weight between normal and tumor-bearing mice at different time points

3 討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童多發(fā)的惡性腫瘤之一。已經(jīng)有研究［1，3，8］利用 4－6 周齡的BALB/c 小鼠成功建立了神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型，并開展了相關(guān)研究。其中在潛伏期方面，我們與陳嘉波等的報(bào)道比較接近。在接種成功率方面，我們與郝希偉等［9］的報(bào)道較為相近，而與李霞等［6］和徐惠綿等［7］利用 BALB/c 小鼠建立黑色素瘤、結(jié)腸癌、胃癌移植瘤模型90%以上的成功率相差較大。由此我們認(rèn)為，移植瘤成功率和潛伏期與移植物的種類和活力、接種部位及受試動物的免疫狀態(tài)有很大關(guān)系。

甄林林等［10］和范萍等［11］在制備人乳腺瘤移植模型時(shí)，分別選用了BALB/c裸鼠和正常的BALB/c小鼠，并且都成功的建立了移植瘤模型。但在對實(shí)驗(yàn)動物選擇方面，很多研究［12－16］認(rèn)為，裸鼠缺乏免疫排斥反應(yīng)，移植后腫瘤生長良好，能保持腫瘤細(xì)胞的原有形態(tài)及細(xì)胞動力學(xué)和生物學(xué)特性，是腫瘤模型研究中較為理想、也較為常用的實(shí)驗(yàn)動物。范萍等［11］則認(rèn)為一個(gè)理想的移植瘤動物模型所選實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)為免疫功能正常、成瘤后動物有一定成活期的近交系。國內(nèi)外的一些研究［6，17，18］也認(rèn)為，選用BALB/c小鼠而非裸鼠的原因是BALB/c小鼠的抵抗力強(qiáng)，存活率高，對飼養(yǎng)條件要求較低;其次在研究轉(zhuǎn)移性疾病時(shí)，宿主的免疫反應(yīng)是協(xié)調(diào)因素，可以改變對轉(zhuǎn)移性疾病及化療藥物的生物反應(yīng)，而裸鼠T細(xì)胞免疫功能接近于零，喪失了免疫排斥能力;并且作為實(shí)驗(yàn)動物，其成本高，推廣價(jià)值較低。對此，我們比較認(rèn)同范萍等的觀點(diǎn)，并利用具有完全免疫功能的BALB/c小鼠建立了神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型。

在利用BALB/c小鼠建立移植瘤模型的報(bào)道中，大多采用4－6周的雌性 BALB/c小鼠［1，19］。我們認(rèn)為選擇單一性別、固定的年齡段是不妥的，在建立一種移植瘤模型時(shí)，應(yīng)從該疾病的常見發(fā)病年齡和性別組成考慮，選擇具有應(yīng)用推廣價(jià)值的接種年齡和性別，這樣建立的模型才會比較全面真實(shí)地反映疾病發(fā)病的真實(shí)狀態(tài)，利于更有效地開展相關(guān)研究。

在腫瘤移植模型制備中，常用瘤細(xì)胞和瘤組織進(jìn)行接種。接種液通常包括細(xì)胞生長培養(yǎng)液［1］、PBS緩沖液［8］和生理鹽水［19］。其中細(xì)胞接種液多用完全培養(yǎng)液、PBS緩沖液，而組織接種液則用生理鹽水和完全培養(yǎng)液。由此可見尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，也未見有關(guān)效果比較的報(bào)道。我們認(rèn)為細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，對環(huán)境條件的要求是比較嚴(yán)格的，離開培養(yǎng)液，細(xì)胞的生長就會停止甚至死亡。為了最大程度地減少接種液和環(huán)境的改變對細(xì)胞的影響，并保持細(xì)胞活力，我們選用培養(yǎng)液來制備接種液，并取得了不錯(cuò)的效果。

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