劉 金，黃 毅，孫艷波，顏亨梅

(1.北京師范大學(xué)珠海分校不動(dòng)產(chǎn)學(xué)院，中國 珠海 519087；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 長沙 410081)

水稻是我國乃至全世界的主要糧食作物，其安全性尤為重要．轉(zhuǎn)基因水稻是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把目的基因轉(zhuǎn)入到水稻中，使水稻具有新的性狀，如抗蟲、抗除草劑、抗病害等．但轉(zhuǎn)基因水稻的安全性在沒有經(jīng)過長期評估之前，其食用安全性仍存在很大爭議．迄今為止，國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因稻谷所做安全性評價(jià)研究主要集中在：李英華等[1]、HAN等[2]、Oberdoerfer等[3]、韓軍花等[4]和Cromwell等[5]分別進(jìn)行了實(shí)質(zhì)等同性分析，LI 等[6]、Momma等[7]、陳小萍等[8]和楊月欣等[9]開展了營養(yǎng)學(xué)評價(jià)，WANG等[10]、王茵等[11]、Herouet等[12]、王忠華等[13]和李英華等[14]分別進(jìn)行了毒理學(xué)評價(jià)，Momma等[7]、Tada等[15]和孫艷波等[16]做了致敏性研究，以及李英華等[17]、卓勤等[18]、王忠華等[19]分別進(jìn)行了致畸作用研究．而轉(zhuǎn)基因稻谷對小鼠的遺傳多態(tài)性影響的研究鮮有報(bào)道．考慮到肝臟和小腸分別是機(jī)體主要的解毒和消化器官，本研究以飼喂轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷子二代(F2)小鼠肝臟和小腸為樣品，進(jìn)行遺傳多態(tài)性變化研究，為轉(zhuǎn)基因稻谷的安全性評價(jià)提供參考．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 稻谷 轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷香125S/Bar68-1(簡稱Bar68-1) [生產(chǎn)許可證號：農(nóng)基安審字(2006)第060號]及其親本——非轉(zhuǎn)基因稻谷香125S/D68(簡稱D68)，均由中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所生產(chǎn)提供．

1.1.2 飼料 常規(guī)基礎(chǔ)飼料[生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2009-0009]，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司．將稻谷、常規(guī)基礎(chǔ)飼料和魚粉按一定比例混合(見表1)后送到中南大學(xué)動(dòng)物飼料廠粉碎壓成根狀，即成小鼠日糧(配合飼料)．其中每千克預(yù)混料含有:VA 3.3 mg，VD 70 μg， VE 45 mg，VK 1.60 mg，VB12.4 mg，VB26.5 mg，VB63.6 mg，VB1238 μg，煙酸92 mg，葉酸0.85 mg，泛酸31 mg，生物素115μg，膽堿285 mg，F(xiàn)e 170 mg，Cu 240 mg，Mn 50 mg，Zn 160 mg，I 1.4 mg，Se 0.4 mg．各組飼料的蛋白質(zhì)、脂肪測定結(jié)果均符合小鼠生長的營養(yǎng)要求[20](w(蛋白質(zhì))≥18%，w(脂肪)≥3%)．

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡、體重18～22 g的SPF級昆明小鼠(Musmusculus)200只，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(生產(chǎn)許可證編號：SCXK(湘)2009-0004)．小鼠按編號隨機(jī)分成5組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只小鼠，雌雄各半．5個(gè)組的日糧組成和營養(yǎng)水平僅稻谷含量有差異．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2．

實(shí)驗(yàn)前給予小鼠常規(guī)基礎(chǔ)飼料[生產(chǎn)許可證編號：SCXK(湘)2009-0009]適用3～5 d．各組小鼠分別供應(yīng)充足的飼料和水，保持鼠房的空氣流通和適當(dāng)?shù)臏囟取穸?溫度22～25 ℃，濕度50%～60%，動(dòng)物照度15 ～20 lx)．親代小鼠飼養(yǎng)90 d后開始繁殖子一代(F1)，以此類推，一直持續(xù)到子二代(F2)．每代小鼠飼養(yǎng)180 d后，分別在2組(Z2組)和4組(C2組)中每次按編號隨機(jī)抓取F2代小鼠6只，雌雄各半．試驗(yàn)重復(fù)3次．

采用小鼠肝臟的和腸的樣品進(jìn)行分析，其中，肝臟樣品和腸樣品各12份，6份取自常規(guī)稻谷(非轉(zhuǎn)基因稻谷)喂養(yǎng)的小鼠，6份取自轉(zhuǎn)基因稻谷喂養(yǎng)的小鼠(見表3)．

表1 日糧原料及成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(干重)/%

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 用于AFLP分析的小鼠材料

1.2 儀器設(shè)備

超純水系統(tǒng)：PL 5124 Purelab Plus UV/UF PALL；高速冷凍離心機(jī)：D-78532 Tuttlingen, hettich zentrifugen, Mikro 22R；PCR儀：T-Gradient Thermoblock, Biometra；超低溫冰箱：U410 Ultra low temperature freezer, Premium；高溫滅菌鍋：HVE-50, HIRAYAMA；凝膠成像系統(tǒng)：Gel Doc 1000 Single, Wavelength Mini-Transilluminator，BIO-RAD, Hercules, CA, USA.

1.3 試劑

AFLP引物：上海捷瑞生物工程有限公司合成.EcoRI接頭： 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′, 5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′.MseI接頭： 5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′,5′-TACTCAGGACTCAT-3′ .預(yù)擴(kuò)增引物： E+A 5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′, M+C 5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′.選擇性擴(kuò)增引物共10條，為E-AGC、M-CAG、E-ACG、M-CTG、E-ACC、M-CTC、E-ACT、M-CTT、E-ACA、M-CGA(E=GACTGCGTACCAATTC；M=GATGAGTCCTGAGTAA). Taq DNA Polymerase,MseⅠ,EcoRⅠ, T4 Ligase, 100 bp ladder, dNTP，動(dòng)物DNA快速提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖為BIOWEST AGAROSE，其他試劑均為國產(chǎn)分析純．變性上樣緩沖液質(zhì)量分?jǐn)?shù)： 99%甲酰胺、0.25%二甲苯青、0.25%溴酚藍(lán)和10 mmol/L EDTA．

1.4 AFLP分析方法

1.4.1 小鼠基因組DNA的提取 使用天根生化科技(北京)有限公司的動(dòng)物血液組織DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA，并用100 μL TE洗脫，-20 ℃保存樣品．

1.4.2 雙酶切 用MseⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA．體系為：10×PCR Tango 2.5 μL; DNA模板(50 mg/L) 5.0 μL;EcoRⅠ(166.7 mkat/L，即107U/L) 0.5 μL, 滅菌蒸餾水 17.0 μL; 總體積 25 μL．反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃ 2 h, 70 ℃ 30 min, 16 ℃ 10 min; 反應(yīng)完成后再加入 0.5 μLMseⅠ(166.7 mkat/L，即107U/L)，65 ℃ 酶切2 h，然后 80 ℃ 變性30 min, 16 ℃降溫10 min; 酶切產(chǎn)物 -20 ℃保存．

1.4.3 連接反應(yīng) 反應(yīng)體系為10×T4 buffer 2.5 μL, DNA酶切產(chǎn)物10 μL, T4 Ligase(50 mkat/L，即3×106U/L)1.0 μL,EcoRⅠ接頭(10 μmol/L) 2 μL,MseⅠ接頭(10 μmol/L) 2 μL, Sterile deionized water 7.5 μL，總體積為25 μL．于16 ℃溫度下過夜．

1.4.4 預(yù)擴(kuò)增 考察模板用量，對連接產(chǎn)物進(jìn)行稀釋，分別稀釋200倍，10倍，4倍和1倍(原液)．預(yù)擴(kuò)增體系為：10×PCR buffer (含20 mmol/L Mg2+) 2.5 μL, dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL, DNA連接產(chǎn)物 2.0 μL,EcoRⅠ+A(10 μmol/L) 1 μL,MseⅠ+C(10 μmol/L) 1 μL, Taq DNA Polymerase(41.67 mkat/L，即2.5×106U/L) 0.5 μL, 滅菌蒸餾水17.5 μL, 總體積 25 μL．反應(yīng)程序設(shè)為：94 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃ 變性30 s, 56 ℃ 復(fù)性1 min, 72 ℃ 延伸1 min．經(jīng)過20個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸8 min, 16 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.4.5 選擇性擴(kuò)增 對所合成的10條選擇性引物(MseⅠ5條，EcoRⅠ5條)共25種組合進(jìn)行了篩選，選擇其中擴(kuò)增效果較好的引物用于AFLP分析．

對預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行稀釋，分別為200倍、10倍、4倍和1倍(原液)，作為選擇擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用量為 2 μL, 引物為選擇性引物各1 μL，10×PCR buffer (含20 mmol/L Mg2+) 2.5 μL, dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL, Taq DNA Polymerase(41.67 mkat/L) 0.5 μL, 滅菌蒸餾水17.5 μL, 總體積 25 μL．PCR反應(yīng)的程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s, 65 ℃復(fù)性30 s, 72 ℃延伸1 min(共13個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.7 ℃)；94 ℃變性30 s, 56 ℃復(fù)性30 s, 72 ℃延伸1 min(共23個(gè)循環(huán))；72 ℃延伸8 min, 16 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.4.6 聚丙烯酰胺電泳及顯影觀察

(1)電泳分析 在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入25 μL 的變性上樣緩沖液，然后于90 ℃變性5 min，置于冰上冷卻，4 ℃溫度下保存產(chǎn)物．配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%聚丙烯酰胺凝膠，室溫下凝結(jié)1.5 h，然后進(jìn)行梯度電泳，電泳槽的負(fù)極(上槽)加入0.5×TBE電泳緩沖液，下槽用1倍體積 3 mol/L的醋酸鈉溶液和2倍體積的1×TBE緩沖液．上樣量為5 μL，并用200 ladder marker做參照．電壓250 V,電泳2.0 h后進(jìn)行銀染．

(2)銀染 參考Heckel[21]銀染方法，將凝膠從膠板取下，用去離子水沖洗，放入10%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液中固定后用去離子水洗滌一遍，然后用0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的AgNO3溶液銀染，之后用去離子水洗滌2次，最后用顯影液顯影．待條帶清晰后用蒸餾水洗滌一遍，放入Na2CO3溶液中，最后對顯色后的膠塊拍照保存．

(3)銀染結(jié)果分析 用選擇的引物對所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增的多態(tài)圖譜，記錄凝膠圖譜上100～1 500 bp DNA條帶的有或無，條帶清晰可辨的記為“1”，缺失或模糊不清的記為“0”，將觀察的結(jié)果以Excel形式輸入計(jì)算機(jī)，用 NTSYS-pc 2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到聚類結(jié)果．

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

對AFLP的引物組合進(jìn)行選擇，10條引物共有25種配對組合方法，用25對引物分別擴(kuò)增肝和腸樣品，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(見圖1)．從電泳圖譜可看到，大部分引物都能擴(kuò)增出帶型明晰、分布均勻的條帶，從中選擇了6對引物組合用于小鼠遺傳背景的研究(見表4)．

表4 小鼠多態(tài)分析的AFLP引物

2.2 AFLP電泳結(jié)果

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，精確度高，可檢測到AFLP擴(kuò)增條帶的微小差異，更有利于小鼠遺傳差異的探討．通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對各擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，得到了較清晰的多態(tài)性圖譜．其中第1對引物(E-AGC + M-CAG)、第4對引物(E-ACG+ M-CGA)擴(kuò)增的結(jié)果分別見圖2、圖3．從電泳結(jié)果可知，各樣品擴(kuò)增的主要條帶都沒有明顯差異，多態(tài)性條帶很少，但也存在具有差異的弱帶，這可能是實(shí)驗(yàn)條件和誤差造成的．總體來說，小鼠的遺傳背景差異?。?/p>

圖1 AFLP引物篩選聚丙烯酰胺電泳結(jié)果

圖2 第1對引物(E-AGC + M-CAG)擴(kuò)增小鼠樣品的效果

2.3 聚類分析

為了更好地分析小鼠的遺傳背景特征，對聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，共統(tǒng)計(jì)到108條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)僅為28條，多態(tài)率為25.9%．用NTSYS-pc 2.1 軟件進(jìn)行聚類分析，得到的聚類結(jié)果見圖4．

從聚類圖看，各樣品聚類的趨勢不是很明顯．第9號樣品在相似系數(shù)為0.13時(shí)與其他樣品聚集，與其他樣品差別較大；7、8號樣品與12號樣品在相似系數(shù)約為0.09時(shí)，聚集為一支；除10、11號樣品外，Z2組肝臟樣品(7～12號)與其他樣品在較大相似系數(shù)時(shí)聚集．C2組肝臟樣品(1～6號)和17、10、11號樣品聚集為一支，相似系數(shù)為0.06左右．小腸各樣品聚集在0.07到0.11的相似系數(shù)之間．

圖3 第4對引物(E-ACG+ M-CGA)擴(kuò)增小鼠樣品的效果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，小鼠的遺傳背景總體差異比較小，但肝臟和小腸之間存在微小差異，Z2組肝臟樣品和C2組肝臟樣品也有微小差異．

3 討論

分子標(biāo)記是能反映生物個(gè)體或種群間基因組中具有某種差異特征的DNA片段，它直接體現(xiàn)基因組DNA之間存在的差異．幾十年來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)取得了很大的發(fā)展和進(jìn)步．第二代分子標(biāo)記技術(shù)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)是在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(Random Amplified Polymorphic DNA, RPAD)和限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)2種技術(shù)結(jié)合發(fā)展起來的DNA多態(tài)性檢測技術(shù)，兼有簡便、快捷和重復(fù)性高的特點(diǎn)．與PCR相結(jié)合，AFLP技術(shù)能同時(shí)檢測很多數(shù)量的多態(tài)位點(diǎn)和多態(tài)性標(biāo)記．1995年由Zabeau 和Vos[22]發(fā)明以后，該技術(shù)在動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)和微生物學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用．

多態(tài)性(Polymorphism)是指一個(gè)生物群體中，同時(shí)存在2種以上的不連續(xù)的基因型或等位基因，也稱為遺傳多態(tài)性或基因多態(tài)性．從本質(zhì)上講，多態(tài)性的產(chǎn)生來源于基因水平上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域或沒有重要調(diào)節(jié)功能的部分．

轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷的外源基因——Bar基因的表達(dá)產(chǎn)物為膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinthricin acetyl transferase, PAT)．PAT酶能使除草劑中草丁膦的有效成分膦絲菌素(phosphinothricin, PPT)的自由氨基乙酰化，不能抑制谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)活性，從而賦予轉(zhuǎn)基因作物對除草劑的抵抗力，使草丁膦對作物失去活性[23]．PAT作為Bar基因的表達(dá)產(chǎn)物和稻谷的外源成分，在轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷中具有一定的含量．小鼠消化系統(tǒng)在長期受PAT脅迫下，是否發(fā)生DNA多態(tài)性變化，正是作者研究的主要問題．因而，本研究選取消化系統(tǒng)的兩個(gè)重要器官肝臟和小腸為樣品進(jìn)行了試驗(yàn)．結(jié)果顯示，F(xiàn)2代C2組與Z2組各樣品比較，擴(kuò)增的主要條帶都沒有明顯差異，多態(tài)條帶數(shù)量很少，多態(tài)率僅為25.9%；依聚類圖分析，Z2組肝臟和小腸樣品和C2組肝臟和小腸樣品有微小差異，但差異不明顯．可見PAT對小鼠肝臟和小腸的DNA多態(tài)性沒有明顯影響．究其原因，作者認(rèn)為可能與以下原因有關(guān)：(1)PAT在小鼠消化道中會(huì)被消化液消化、降解，失去活性；(2)轉(zhuǎn)Bar基因稻谷中的PAT含量太低，不足以產(chǎn)生明顯的效應(yīng)．具體原因有待于進(jìn)一步研究．

致謝：感謝中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所唐香山博士和湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究生廖四芳等同學(xué)給予大力幫助．

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