蘇利霞,楊華武,趙 瑜,朱卓越 ,陳 雄,楊陟華,朱茂祥

(1.湖南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心,中國 長沙 410014； 2.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，中國 北京 100850)

煙草作為一種特殊商品，滿足了消費者生理和心理方面的需要，但流行病學調(diào)查結(jié)果顯示吸煙對人體健康有一定影響．隨著研究的深入，醫(yī)學界對吸煙與健康的影響也產(chǎn)生了迷惑與分歧，吸煙對健康的危害變得模棱兩可[1]．眾所周知，吸煙對人體健康的影響最終是體現(xiàn)在生物體上[2]，建立生物指標來檢測和評價卷煙對生物體的效應，對低危害卷煙產(chǎn)品的前期開發(fā)和卷煙安全性評價是很有意義的．作者采用離體細胞培養(yǎng)的方法來檢測煙氣濃縮物的細胞毒性、動式被動吸煙小鼠急性毒性試驗來檢測煙氣的急性毒性，共測定國內(nèi)外20個不同品牌的卷煙[3]，試驗采用2個生物學指標：細胞死亡率和小鼠半數(shù)死亡時間，將該數(shù)據(jù)制成加權數(shù)值表，來初步評價卷煙煙氣的有害生物效應和煙氣中的亞硝胺、氫氰酸含量的相關性．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用煙采用在市面上隨機抽樣提供，每支煙質(zhì)量為0.90～0.92 g．

1.2 主要試劑

無血清的LHC-12 培養(yǎng)液(Gibco 公司)，LHC基礎培養(yǎng)液(Biofluids Biobource INC)，胰蛋白酶(Gibco 公司)，胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma 公司)，噻唑蘭(MTT，Amersham LIFE SCIENCE)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)(Sigma 公司)，乙腈(Merck公司)，乙酸(Merck公司)，乙酸胺(Merck公司)，其余均為市售分析純試劑．

1.3 主要實驗儀器

JJD100 型單通道吸煙機(鄭州煙草研究所)，MOODEL 2300 CO2孵箱(Sheldon制造有限公司)，月壇牌潔凈工作臺(北京冠鵬凈化設備有限公司)，TDL-5T臺式離心機(重慶光學儀器廠)，LXJ-64-01型離心機(北京醫(yī)療儀器修理廠)，KUBOTA 6930型低溫離心機(久保田商事株式會社)，Thermo Forma低溫冰箱(Thermo Electron 公司)，MCC/340 P酶標儀(Multiakan公司), HH-SY21-Ni4C型電熱恒溫水浴鍋(北經(jīng)長風儀器儀表公司), SARTORIUS BS210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司),API3000液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司)．AAⅢ型連速流動分析儀(德國BRAN&RU BBE公司)．

1.4 細胞培養(yǎng)

永生化人支氣管上皮細胞系BEP2D，以LHC-8無血清培養(yǎng)液(LHC-8 SERUM-FREE MEDIUM with GLUTAMINE)培養(yǎng),接種于25 cm2或75 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，以95%相對濕度、體積分數(shù)為5%(下同)的CO2、37 ℃在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；細胞每周傳代1次，傳代后2天換1次液．

1.5 卷煙煙氣凝集物(CSC)制備

JJD100 型單通道吸煙機設定為1 口/min，分別經(jīng)過5 mL 有機相(95%的乙醇) 和5 mL 無機相(LHC-12 培養(yǎng)液)收集20 支卷煙的煙氣，分裝后于-80 ℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

1.6 MTT 法檢測

把培育的細胞用微孔濾膜過濾除菌后，以LHC-8培養(yǎng)液稀釋至所需濃度進行染毒．收集處于指數(shù)生長的BEP-2D細胞，按109個/L接種96孔培養(yǎng)板中，其中1排孔作為陰性對照，不作任何處理；另1排孔作為空白對照，分別進行試驗煙和對照煙的細胞染毒，每種卷煙設計10個染毒劑量．用2.5 g/L胰蛋白酶消化BEP2D細胞,并且準確計數(shù)．然后用LHC-8培養(yǎng)液稀釋單個細胞懸液，以每孔8 000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL;將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37 ℃、5%CO2和95%相對濕度條件下，培養(yǎng)24 h；然后以不同濃度CSC 對細胞染毒，每個劑量設4個平行樣，終體積仍保持200 μL， 染毒培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL,37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO,震蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解．選擇570 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔OD值，記錄結(jié)果[4]．

1.7 TSNA含量檢測

將收集了主流煙氣粒相物的濾片置于小玻璃瓶中，加入100 μL 5 mg/L的內(nèi)標混合溶液和10 mL的0.1 mol/L乙酸銨水溶液，封好玻璃瓶，置于回旋震蕩器上以180 r/min轉(zhuǎn)速振蕩萃取30 min；分別用1 mL 的甲醇和水先后潤洗固相萃取小柱，移取1.0 mL萃取液，用120 μL的1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液將萃取液調(diào)為堿性，堿性液上OASIS MCX (30 mg)固相萃取柱，用1 mL水淋洗，然后用1.0 mL 50%甲醇(體積分數(shù))的水溶液將分析物洗脫，洗脫液裝入液相進樣小瓶，以備LC/MS/MS分析[5]．

1.8 HCN含量檢測

按YC/T 29-1996標準抽取5支卷煙后，將收集了主流煙氣粒相物的濾片置于小玻璃瓶中，加入50 mL 0.1 mol/L NaOH溶液常溫下震蕩30 min，用裝有過濾頭5 mL一次性針筒抽取濾液，裝入樣品瓶內(nèi)進行連速流動分析；用裝有30 mL 0.1 mol/L NaOH溶液的吸收瓶撲集5支卷煙主流煙氣氣相中的HCN，吸畢，用0.1 mol/L NaOH溶液淋洗吸收瓶與主流煙氣接觸的部分，合并撲集液與淋洗液，用0.1 mol/L NaOH溶液定容至50 mL，取約2 mL裝入樣品瓶中進行連速流動分析；根據(jù)吸光度和工作曲線計算撲集液中的HCN濃度，卷煙煙氣中的HCN釋放量為粒相(濾片)與氣相(吸收瓶)中HCN測定量之和[6]．

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠急性毒性暴露卷煙煙氣的半數(shù)死亡時間按急毒大小排序

表1 小鼠急性毒性暴露卷煙煙氣的半數(shù)死亡時間按急毒大小排序表

2.2 樣品煙氣濃縮物按細胞毒性大小排序

采用相同的實驗條件，分別對20個不同品牌的卷煙進行動物急性毒性、細胞閾劑量及細胞半數(shù)致死劑量測定比較，進行One-Sample T Test 分析(表2),發(fā)現(xiàn)沒有統(tǒng)計學協(xié)同性差異．

2.3 按加權綜合毒性大小排序

采用2個生物學指標，并采用加權法來比較20個品牌的卷煙煙氣的有害生物學效應，見表3．

表2 樣品煙氣濃縮物毒性列表(按急毒大小排序)

表3 卷煙煙氣加權綜合毒性列表

2.4 樣品煙氣濃縮物細胞生物加權綜合毒性大小和煙氣中的亞硝胺含量和氫氰酸含量測定結(jié)果

從表4、圖1、圖2中可以看出：不同品牌的卷煙煙氣的有害生物學效應存在一定的差異，在進行卷煙安全性評價時，生物加權綜合毒性大小與亞硝胺、氫氰酸含量沒有明顯的線性關系．造成這種現(xiàn)象的原因可能為： CSC是一種混合物，各種有害組分之間也可能是一種疊加或協(xié)同作用[9-14]，卷煙的有害生物效應與單個化合物組分的含量關系并不很密切．

表4 樣品煙氣濃縮物細胞生物加權綜合毒性和煙氣中的亞硝胺、氫氰酸含量

圖1 生物加權綜合毒性大小與總TSNA變化關系圖Fig.1 The relationship between bio-weighted composite toxicity total with TSNA

圖2 生物加權綜合毒性與總HCN變化圖Fig.2 The relationship between bio-weighted composite toxicity with HCN

3 小結(jié)

本實驗通過對卷煙煙氣冷凝物(CSC)中具有代表性的TSNA、HCN的有害成分細胞毒性進行分析，發(fā)現(xiàn)TSNA、HCN與 CSC都具有體外細胞毒性，但是不同品牌的卷煙煙氣的有害生物學效應存在一定差異，在進行卷煙安全性評價時，生物加權綜合毒性大小與亞硝胺、氫氰酸含量沒有明顯的線性關系．造成這種現(xiàn)象的原因可能為： CSC是一種混合物，各種有害組分之間可能存在一種疊加或協(xié)同作用，卷煙的有害生物效應與單個化合物組分的含量關系并不很密切．因此煙草行業(yè)和社會公眾需要科學、全面、客觀地評價卷煙煙氣危害性，煙草行業(yè)也要致力于降低煙氣中的有害成分．

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