曹偉偉，朱曉娜，李明靜,2*

(1.河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 開封 475004； 2.河南大學(xué) 河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004)

酪氨酸酶(TYR)又稱多酚氧化酶，兒茶酚氧化酶，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中[1].酪氨酸酶是生物合成黑色素細(xì)胞的主要限速酶，抑制酪氨酸酶的活性，可改善皮膚色素細(xì)胞中酪氨酸酶的代謝，阻止色素沉著，達(dá)到美白效果[2]. 已應(yīng)用于美白化妝品中的化學(xué)合成美白劑如氫醌則因具有較大的細(xì)胞毒性目前已較少采用. 天然植物提取物具有無毒、安全等特點(diǎn)，因此，天然植物類化妝品的開發(fā)研究越來越受到國內(nèi)外廣大消費(fèi)者的青睞，同時(shí)具有很大的市場(chǎng)潛力. 茶多酚的主要成分是兒茶素[3]，具有清除人體自由基、祛斑、防曬等作用[4]. 金銀花葉子中主要有木犀草素、木犀草苷、忍冬苷等黃酮類化合物[5], 這些黃酮類物質(zhì)是一種天然的抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基及抗衰老等作用，其中木犀草素還具有抗菌、抑酶等作用. 丹皮酚又稱牡丹酚，研究證實(shí)[6]丹皮酚具有抗炎、抗菌、抑制皮膚色素合成、消瘀化斑等作用. 鑒于茶多酚、丹皮酚及木犀草素都具有抑制黑色素形成的特點(diǎn)，本文作者研究其抑制酪氨酸酶活性，為開發(fā)天然植物提取物在美白化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用開辟新的途徑.

大多黃酮類化合物在水中較難溶解，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7,8]常用甲醇、乙醇、DMSO等溶劑溶解黃酮類化合物，但我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇、DMSO對(duì)酪氨酸酶均有很強(qiáng)的抑制作用. 本文通過大量實(shí)驗(yàn)篩選出了既可以增大金銀花葉子總黃酮及丹皮酚在水中的溶解度同時(shí)對(duì)酪氨酸酶活性又不產(chǎn)生影響的新溶劑體系，即1%丙三醇和1%吐溫-80(體積比1∶1)混合溶液作為溶劑體系，并分別研究了茶多酚、丹皮酚、金銀花葉子總黃酮提取物等對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

酪氨酸酶(965 U/mg)，3,4-二羥基苯氨酸(L-DOPA)，購于上海寶曼生物科技有限公司；茶多酚，實(shí)驗(yàn)室自制(從信陽毛尖中提取，純度85%)；金銀花葉子乙酸乙酯提取物，實(shí)驗(yàn)室自制(以蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得總黃酮含量為86%)；丹皮酚，實(shí)驗(yàn)室自制(從牡丹皮中提取，純度99%)；Vc，丙三醇，吐溫-80，K2HPO4·3H2O，KH2PO4等試劑均為國產(chǎn)分析純；二次蒸餾水.

1.2 儀器

紫外可見分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省豫華儀器有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 測(cè)定溶液的配制

二次蒸餾水做溶劑，配制0.010 mol/L的多巴溶液，50 U/mL的酪氨酸酶溶液.

1%的丙三醇和1%吐溫-80(體積比1∶1)混合液做溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為0.25 g/L的Vc溶液、4.00 g/L的金銀花葉子總黃酮提取物溶液、1.20 g/L的茶多酚溶液、1.06 g/L的丹皮酚溶液.

1.3.2 提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率計(jì)算[9,10]

按照如下公式計(jì)算Vc、茶多酚、丹皮酚、金銀花葉子總黃酮提取物及復(fù)配物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率

式中，A1是加酪氨酸酶，不加提取液，只加多巴溶液時(shí)的吸光度；A2是加酪氨酸酶，不加提取液，不加多巴溶液時(shí)的吸光度；A3是加酪氨酸酶，加提取液，加多巴溶液時(shí)的吸光度；A4是加酪氨酸酶，加提取液，不加多巴溶液時(shí)的吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7,8]，提取黃酮類、多酚類物質(zhì)常用甲醇、乙醇、DMSO等做溶劑.但我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇、DMSO對(duì)酪氨酸酶均有很強(qiáng)的抑制作用.丹皮酚和金銀花葉子提取物在水中溶解度較小，有文獻(xiàn)報(bào)道[11]表面活性劑對(duì)難溶化合物具有一定的增溶作用，本實(shí)驗(yàn)通過加入表面活性劑顯著增大了丹皮酚和金銀花葉子提取物在水中的溶解度. 通過實(shí)驗(yàn)選擇了既可以增大黃酮類化合物在水中的溶解度，同時(shí)對(duì)酪氨酸酶活性又不產(chǎn)生影響的溶劑體系，實(shí)驗(yàn)分別選取1%丙三醇、1%吐溫-80、0.5%丙三醇和0.5%吐溫-80(體積比1∶1)、1%丙三醇和1%吐溫-80(體積比1∶1)、二次水、甲醇、乙醇、DMSO等溶劑體系.

以多巴為底物， 35 ℃恒溫條件下，向10 mL比色管中加入50 U/mL 的酪氨酸酶溶液2.0 mL，3.5 mL的磷酸鹽緩沖液(pH=6.5)，再加入濃度為0.010 mol/L多巴溶液2.0 mL，分別用1%丙三醇、1%吐溫-80、0.5%丙三醇和0.5%吐溫-80(體積比1∶1)、1%丙三醇和1%吐溫-80(體積比1∶1)、二次水、甲醇、乙醇、DMSO定容，搖勻，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在475 nm處測(cè)定吸光度A，開始6 min每分鐘測(cè)一次，以后每隔2 min測(cè)一次，至12 min.結(jié)果如圖1所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明除甲醇、乙醇、DMSO以外的上述其他溶劑體系對(duì)酪氨酸酶活性均沒有影響，并且其中 1%丙三醇和1%吐溫-80(體積比1∶1)溶劑體系可顯著增大丹皮酚和金銀花葉子提取物在水中的溶解度，故選擇1%丙三醇和1%吐溫-80(體積比1∶1)混合液作為溶劑體系.

2.2 不同植物提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

2.2.1 Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒溫條件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸鹽緩沖液，再分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL 0.25 g/L Vc溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒溫2 min，在475 nm處測(cè)定吸光度，按照1.2.2的方法計(jì)算抑制率.不同濃度的Vc對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用如圖2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著Vc濃度的增大，對(duì)酪氨酸酶的抑制作用增強(qiáng)，抑制率達(dá)到50%的Vc質(zhì)量濃度(IC50) 為14.51 mg/L. Vc能夠顯著地抑制細(xì)胞黑色素形成，也是公認(rèn)的祛斑美白劑.

1. 1%丙三醇2. 1%吐溫-803. 0.5%丙三醇和0.5%吐溫-804. 1%丙三醇和1%吐溫-805. 二次水6. 甲醇7. 乙醇8. DMSO圖1 不同溶劑對(duì)酪氨酸酶活性的影響Fig.1 Different solvents on activity of tyrosinase

圖2 Vc對(duì)酪氨酸酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Vc on activity of tyrosinase

2.2.2 茶多酚對(duì)酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒溫條件下，向10mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸鹽緩沖液，再分別加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7 mL 1.20 g/L的茶多酚溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒溫2 min，在475 nm處測(cè)定吸光度，按照1.2.2的方法計(jì)算抑制率.不同濃度的茶多酚對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用如圖3所示，結(jié)果表明隨著茶多酚濃度的增大，對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)茶多酚的質(zhì)量濃度達(dá)到0.20 g/L時(shí)，對(duì)酪氨酸酶的抑制率達(dá)到62.20%. 抑制率達(dá)到50%的茶多酚質(zhì)量濃度(IC50)為0.113 0 g/L.與對(duì)照品Vc相比茶多酚對(duì)酪氨酸酶具有較好的抑制效果，將成為一種新型功能性化妝品添加劑應(yīng)用于美白化妝品中.

2.2.3 金銀花葉子總黃酮提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒溫條件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸鹽緩沖液，再分別加入0.5、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 4.00 g/L金銀花葉子總黃酮提取物溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒溫2 min，在475 nm處測(cè)定吸光度，按照1.2.2的方法計(jì)算抑制率. 不同濃度的金銀花葉子總黃酮提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用如圖4所示，隨著總黃酮提取物濃度增大，抑制率增大，當(dāng)總黃酮提取物的質(zhì)量濃度達(dá)到0.6 g/L后，抑制率幾乎保持不變，與對(duì)照品Vc相比金銀花葉子總黃酮提取物對(duì)酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12]金銀花葉子提取物既具有抑菌效果又有一定的抗羥基自由基作用，因此，將金銀花葉子提取物與其他美白劑聯(lián)合使用將會(huì)在美白、抗衰老化妝品領(lǐng)域有一定的應(yīng)用前景.

2.2.4 丹皮酚對(duì)酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒溫條件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸鹽緩沖液，再分別加入0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7、2.0 mL 1.06 g/L丹皮酚溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒溫2 min，在475 nm處測(cè)定吸光度，按照1.2.2的方法計(jì)算抑制率. 不同濃度的丹皮酚對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用如圖5所示，當(dāng)?shù)てし拥馁|(zhì)量濃度達(dá)到0.14 mg/L時(shí)，抑制率達(dá)到44.50%，隨著丹皮酚濃度增加抑制率幾乎不變，與對(duì)照品Vc相比丹皮酚具有一定的抑制酪氨酸酶活性的作用，可考慮將丹皮酚與抑制酪氨酸酶活性較好的Vc或茶多酚復(fù)配作為化妝品添加劑，使其達(dá)到更好的美白效果.

2.2.5 茶多酚和丹皮酚復(fù)配對(duì)酪氨酸酶活性的抑制

35 ℃恒溫條件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸鹽緩沖液，再分別加入0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、2.0、2.5、3.0、3.5 mL茶多酚和丹皮酚混合溶液(茶多酚的質(zhì)量濃度為1g/L，丹皮酚的質(zhì)量濃度為0.5 g/L)，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒溫2 min，在475 nm處測(cè)定吸光度，按照1.2.2的方法計(jì)算抑制率. 不同濃度的茶多酚和丹皮酚復(fù)配物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用如圖6所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明茶多酚與丹皮酚復(fù)配具有較好的抑制酪氨酸酶活性的作用，可考慮將茶多酚與丹皮酚復(fù)配作為美白化妝品添加劑.

圖3 茶多酚對(duì)酪氨酸酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of tea polyphenols on activity of tyrosinase

圖4 金銀花葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of extracts from honeysuckle leaves on activity of tyrosinase

圖5 丹皮酚對(duì)酪氨酸酶的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of paeonol on activity of tyrosinase

圖6 茶多酚和丹皮酚混合液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of mixture of tea polyphenols and paeonol on activity of tyrosinase

1：Vc∶丹皮酚=1∶2(質(zhì)量比)；2：Vc∶丹皮酚=1∶1(質(zhì)量比)圖7 Vc和丹皮酚混合液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of mixture of Vc and paeonol on activity of tyrosinase

2.2.6 Vc和丹皮酚復(fù)配對(duì)酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒溫條件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸鹽緩沖液，再分別加入0.1、0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0 mL Vc和丹皮酚混合溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒溫2 min，在475 nm處測(cè)定吸光度，按照1.2.2的方法計(jì)算抑制率.

Vc和丹皮酚按質(zhì)量濃度1∶1混合(Vc的質(zhì)量濃度為0.17 g/L，丹皮酚的質(zhì)量濃度為0.17 g/L)，測(cè)定混合液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用.

Vc和丹皮酚按質(zhì)量濃度1∶2混合(Vc的質(zhì)量濃度為0.17 g/L，丹皮酚的質(zhì)量濃度為0.34 g/L)，測(cè)定混合液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Vc和丹皮酚按照1∶1、1∶2(質(zhì)量比)復(fù)配對(duì)酪氨酸酶的活性均有較好的抑制效果，可考慮將Vc與丹皮酚復(fù)配作為美白化妝品添加劑，使其達(dá)到安全、高效的抑制黑色素形成的目的。

3 結(jié)論

本文通過大量實(shí)驗(yàn)篩選出了既可以顯著增大黃酮類化合物在水中的溶解度又對(duì)酪氨酸酶活性不產(chǎn)生影響的新的溶劑體系，即1%丙三醇和1%吐溫-80(體積比1∶1)溶劑體系，同時(shí)為天然黃酮類化合物抑制酪氨酸酶活性的研究提供了新的方法.

本文作者對(duì)茶多酚、丹皮酚、金銀花葉子總黃酮提取物以及茶多酚與丹皮酚、Vc與丹皮酚的復(fù)配分別進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它們對(duì)酪氨酸酶的活性均有一定的抑制作用，并且抑制作用從強(qiáng)到弱依次為Vc、Vc∶丹皮酚=1∶2(質(zhì)量比)、Vc∶丹皮酚=1∶1(質(zhì)量比)、茶多酚、茶多酚∶丹皮酚=2∶1(質(zhì)量比)、丹皮酚、金銀花葉子總黃酮提取物. 這些天然植物提取物在美白化妝品領(lǐng)域?qū)?huì)有一定的應(yīng)用前景.

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