屈 鋒，劉弘洋，吳景剛

（北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081）

1 實(shí)驗(yàn)選題的意義

現(xiàn)代分析化學(xué)方法及技術(shù)的應(yīng)用是當(dāng)今科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要基礎(chǔ)，也是衡量一個國家科學(xué)技術(shù)發(fā)展水平的重要標(biāo)志之一。當(dāng)今的生物、醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等眾多學(xué)科領(lǐng)域的前沿研究，無一不是以現(xiàn)代分析化學(xué)的方法和技術(shù)為基礎(chǔ)和手段（如人類基因測序、蛋白質(zhì)組學(xué)研究、食品安全檢測、環(huán)境保護(hù)監(jiān)測等），因此學(xué)習(xí)現(xiàn)代分析化學(xué)基本方法和實(shí)驗(yàn)技能對于多學(xué)科基礎(chǔ)研究和多行業(yè)實(shí)際應(yīng)用具有極其重要的意義［1］。當(dāng)前，我國分析化學(xué)專業(yè)的人才大多是通過綜合大學(xué)的化學(xué)學(xué)科分析化學(xué)專業(yè)培養(yǎng)，而大多數(shù)生物、醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等專業(yè)的學(xué)生在本科階段和研究生階段都很難有機(jī)會深入學(xué)習(xí)和完整掌握現(xiàn)代分析化學(xué)的基本方法和實(shí)驗(yàn)技能。他們在解決科研和實(shí)際生產(chǎn)中的具體問題時常常面臨現(xiàn)代分析化學(xué)知識和實(shí)驗(yàn)技能的不足。因此，有目的地培養(yǎng)非分析化學(xué)專業(yè)的學(xué)生對現(xiàn)代分析化學(xué)新技術(shù)、新方法的認(rèn)知，加強(qiáng)學(xué)生實(shí)踐技能訓(xùn)練、提高學(xué)生實(shí)際動手能力，并借此培養(yǎng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力，對于相關(guān)學(xué)科的研究型人才培養(yǎng)十分必要［2］。

毛細(xì)管電泳技術(shù)（capillary electrophoresis，CE）作為分析化學(xué)學(xué)科前沿和熱點(diǎn)之一，不僅是微流控芯片技術(shù)的基礎(chǔ)，也是聯(lián)系電泳和液相色譜分析方法之間的新型分析技術(shù)，在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展空間。目前分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的儀器分析基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)大都是經(jīng)典的光學(xué)、電化學(xué)、色譜等驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。而生物學(xué)專業(yè)中，電泳實(shí)驗(yàn)是最重要也是最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)，大都只在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中有所涉及。毛細(xì)管電泳技術(shù)作為新型分析技術(shù)，與傳統(tǒng)電泳和液相色譜技術(shù)相比，具有高效、快速、實(shí)驗(yàn)成本低、試劑和樣品用量少，以及儀器操作簡單等突出特點(diǎn)［3］。本文主要介紹以我校生命學(xué)院二年級生物工程和生物技術(shù)專業(yè)本科生為對象，開設(shè)蛋白質(zhì)和核酸同時分析檢測的基礎(chǔ)型開放實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容。

蛋白質(zhì)和核酸是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)物質(zhì)，蛋白質(zhì)和核酸的分析檢測是生物學(xué)研究中必不可少的內(nèi)容［4］。凝膠電泳是蛋白質(zhì)和核酸分析的經(jīng)典方法，目前仍廣泛應(yīng)用［5］。凝膠電泳實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)專業(yè)本科生的基礎(chǔ)教學(xué)實(shí)驗(yàn)，通常分別使用PAGE或SDSPAGE和瓊脂糖凝膠電泳定性檢測蛋白質(zhì)和核酸。本開放實(shí)驗(yàn)利用毛細(xì)管電泳同時分析蛋白質(zhì)和核酸，目的是向?qū)W生介紹毛細(xì)管電泳高效、快速、成本低、試劑和樣品用量少、分析模式多樣等突出的特點(diǎn)，開闊學(xué)生的知識面，了解利用現(xiàn)代毛細(xì)管電泳分析技術(shù)快速進(jìn)行蛋白質(zhì)與核酸的同時定性、定量分析，并且比較毛細(xì)管電泳與經(jīng)典凝膠電泳方法在原理及儀器和實(shí)驗(yàn)操作上的差異。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

（1）掌握毛細(xì)管電泳的原理，能熟練使用毛細(xì)管電泳儀。

（2）了解毛細(xì)管區(qū)帶電泳同時分析蛋白質(zhì)和核酸的基本原理，了解影響分析效果的因素，學(xué)習(xí)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的方法，確定優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件。

（3）了解蛋白質(zhì)和核酸樣品的荷電特性，學(xué)習(xí)利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳對蛋白質(zhì)和核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性、定量分析的方法。

（4）學(xué)習(xí)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正確的總結(jié)和討論，以及對實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的問題進(jìn)行正確分析的方法。

2.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

本實(shí)驗(yàn)通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分析牛血清白蛋白（BSA）及單鏈核酸序列（ssDNA：5’－GGT TGG TGT GGT TGG－3’）標(biāo)準(zhǔn)樣品，確定蛋白質(zhì)和單鏈核酸的出峰順序?？疾祀娪倦妷骸⒎蛛x溫度、電解質(zhì)溶液的pH值及有機(jī)溶劑和線性高分子聚合物添加劑對分析結(jié)果的影響。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent CE毛細(xì)管電泳儀配有DAD檢測器及恒溫控制系統(tǒng)（Agilent公司）；漩渦混合器XW－80A（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司 ）；Adventurer電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；pH 211酸度計(jì)（意大利 HANNA 儀器公司）；移液器（0.5～10μL，20～200μL，100～1 000μL，dragon公司）；超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；熔融石英毛細(xì)管柱（邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司）。

3.2 實(shí)驗(yàn)試劑

H3BO3（北京化學(xué)試劑公司）；Na2B4O7·10H2O（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司 ）。以上試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)中使用高純水配制溶液。

BSA購自北京紐樸生物技術(shù)有限公司；ssDNA購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件

75μm內(nèi)徑熔融石英毛細(xì)管，長度33.5cm（有效長度 22.5cm），分離電壓 10kV，氣壓進(jìn)樣 50 mbar10s，214nm 紫外檢測。50mMol／L H3BO3／Na2B4O7（pH 8.7）作為緩沖溶液，DMSO作中性標(biāo)記物。新毛細(xì)管在使用前用1mol／L NaOH、0.1mol／L NaOH和去離子水依次沖洗30min進(jìn)行活化；每2次進(jìn)樣之間依次用0.1mol／L NaOH、去離子水、緩沖溶液分別沖洗5min。

4 結(jié)果與討論

4.1 實(shí)驗(yàn)原理

毛細(xì)管電泳中，由熔融石英毛細(xì)管產(chǎn)生的電滲流大小決定溶液中組分的遷移速率，此外，蛋白質(zhì)和核酸分子還受自身表面電荷和質(zhì)量（荷質(zhì)比）的影響。蛋白質(zhì)與核酸分子因自身性質(zhì)差異導(dǎo)致其在電泳過程中的遷移速率不同而分離［6］。因此，影響蛋白質(zhì)和核酸分子分離的主要因素有電場強(qiáng)度、電解質(zhì)溶液的組成和濃度以及電泳過程中的分離溫度。

4.2 蛋白質(zhì)和核酸峰的確定

以50mmol／L H3BO3／Na2B4O7（pH 8.7）為緩沖溶液，在214nm紫外波長下檢測DMSO、BSA和ssDNA；通過單組分進(jìn)樣可以確定，出峰順序依次為DMSO、BSA、ssDNA（圖1），即3種組分的遷移速率為DMSO＞BSA＞ssDNA。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因是DMSO為中性分子，不帶電荷，電泳過程中作為電滲流的標(biāo)記分子最先出峰，BSA的等電點(diǎn)為4.9，在pH 8.7電解液中帶負(fù)電荷，因此遷移較中性分子DMSO慢，ssDNA因大量磷酸基團(tuán)存在而帶更多的負(fù)電荷［7］，電泳過程中遷移速率最小，遷移時間最短。

圖1顯示，3種樣品混合進(jìn)樣時，當(dāng)樣品中BSA的濃度增加，其峰面積相應(yīng)有所增加。此外，3種組分3次重復(fù)測定結(jié)果顯示，其遷移時間的RSD值在0.43%～1.06% 之間（見表1）。以上結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)條件下，蛋白質(zhì)和核酸分子可以實(shí)現(xiàn)同時分離，且遷移時間的重復(fù)性很好。

圖1 BSA與ssDNA標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物的電泳圖

表1 BSA與ssDNA分離的遷移時間重復(fù)性（n＝3）

4.3 電壓對分離的影響

電泳電壓影響電滲流和組分的遷移速度，影響組分的遷移時間。遷移速率（v）與工作電壓間有一線性關(guān)系：v＝qE／6（q：樣品的有效電荷；E：電場強(qiáng)度；γ：樣品的表觀液態(tài)動力學(xué)半徑；η：介質(zhì)的黏度），即當(dāng)毛細(xì)管長度一定時，電滲流速度與工作電壓呈正比［8］。

當(dāng)分離電壓為10～20kV時，3組分的表觀遷移時間隨電泳電壓增大而明顯加快，遷移時間縮短（見圖2）。扣除電壓增加導(dǎo)致的電滲流增大等因素，3組分的相對電泳遷移時間基本穩(wěn)定，其RSD值＜3% （見表2），說明相對電泳遷移時間可作為毛細(xì)管區(qū)帶電泳中組分定性的可靠參數(shù)［9］。此外，應(yīng)用高電壓可加快電泳分析速度，但也可能使組分的分辨率降低，且產(chǎn)生較大的焦耳熱，影響基線穩(wěn)定和靈敏度［10］。

圖2 不同電壓對分離的影響

表2 電壓對相對遷移時間的影響（IB－BSA，Is－ssDNA，ID－DMSO）

4.4 分離溫度的影響

分離過程的溫度影響電解質(zhì)溶液的黏度（溫度每變化1，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%），從而影響電滲流，最終影響組分在電介質(zhì)中的擴(kuò)散。另外，由于緩沖液的pH值和蛋白質(zhì)等電點(diǎn)都可能隨溫度而變，所以溫度還可能影響蛋白質(zhì)所帶的電荷［11］。實(shí)驗(yàn)考察15℃、20℃、25℃ 溫度下對分離效果的影響，結(jié)果見圖3。低溫時，有利于提高分辨率，如15℃時，核酸出現(xiàn)峰型分裂，可能因樣品存在雜質(zhì)。高溫時，溶液黏度降低，電滲流增大，組分遷移時間縮短。故隨溫度升高，各組分遷移時間相應(yīng)縮短。

圖3 分離溫度對遷移時間的影響

4.5 緩沖液pH對分離的影響

電泳溶液的pH不僅影響毛細(xì)管內(nèi)壁表面硅羥基的電離程度［12］，而且影響組分的表面電荷，特別是對兩性分子蛋白質(zhì)，其表面電荷受其等電點(diǎn)以及溶液pH影響，從而影響遷移時間。實(shí)驗(yàn)比較了緩沖液pH 7.4～8.7對分離的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 緩沖液pH對分離的影響

適當(dāng)提高電泳溶液pH，可以增加電滲流，表觀淌度增加，相對分離時間縮短，分離效率提高；另一方面，改變電泳溶液pH，可改變?nèi)苜|(zhì)所帶電荷的性質(zhì)或數(shù)量，使溶質(zhì)淌度改變，從而改變分離選擇性，增加分離度［13］。由圖4結(jié)果可知，隨緩沖液pH增大，BSA和ssDNA峰型尖銳，峰高增大明顯，峰的分辨率提高，與理論推斷相符。

4.6 其他因素對分離結(jié)果的影響（選做）

完成上述實(shí)驗(yàn)內(nèi)容后，還可進(jìn)一步選作其他條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，如：電解質(zhì)濃度的影響；加入有機(jī)溶劑的影響；加入高分子聚合物篩分介質(zhì)的影響等。

5 結(jié)束語

本開放實(shí)驗(yàn)的目的在于拓寬生物學(xué)專業(yè)學(xué)生對經(jīng)典教材和實(shí)驗(yàn)課教學(xué)內(nèi)容的認(rèn)知，了解蛋白質(zhì)和核酸分析的新方法，了解現(xiàn)代分析新技術(shù)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用潛力。作為開放實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中的很多環(huán)節(jié)都可由學(xué)生自行設(shè)計(jì)，例如學(xué)生可進(jìn)一步選擇感興趣的蛋白質(zhì)組分和核酸組分設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，考察影響蛋白質(zhì)和核酸混合物分離的主要因素，為CE毛細(xì)管電泳法在研究型課題中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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