唐和斌，陳倍璠，冷昌龍

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074)

免疫組織化學(xué)又稱免疫細胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、半定量測定的一項技術(shù)［1，2］，根據(jù)標(biāo)記物的不同可分為酶免疫組化、熒光免疫組化、親和免疫組化、免疫金(銀)細胞染色組化和免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)等［3］.

免疫組化技術(shù)廣泛運用于藥理學(xué)和病理學(xué)研究.傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)以免疫單染為主，近年來的雙重免疫染色法是在一張切片上進行兩種不同染色的方法，以了解不同細胞、組織、甚或同一種細胞內(nèi)抗原之間的相互關(guān)系［4］.目前報道的雙重免疫染色法有免疫組化和免疫組化、免疫組化和原位雜交、免疫組化和特殊染色等，而免疫酶法和免疫熒光雙結(jié)合的染色檢測方法鮮見.本文以疼痛研究中常用的原代細胞DRG培養(yǎng)細胞為對象，研究其培養(yǎng)系各型細胞中P物質(zhì)及其受體NK-1R的定位關(guān)系，以建立這種新的免疫熒光-酶雙重染色技術(shù).

1 材料

1.1 試劑和儀器

L-Glutamine、DMEM培養(yǎng)基、馬血清均(美國，GIBCO公司)，D-Glucose(美國，AMRESCO 公司)，兔抗鼠GFAP多克隆抗體，兔抗鼠SP多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗大鼠MAP-2多克隆抗體、兔抗鼠S100多克隆抗體、鼠抗鼠NK-1R多克隆抗體(英國，ABCAM)，Laminin、膠原酶(美國，SIGMA-ALORICH 公司)，Heal Force HF151/212培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股集團)，熒光顯微鏡系統(tǒng)(日本，Nikon Eclipse Ti).

1.2 動物

Wistar雄性大鼠4只，6～9周齡，150～210 g(湖北省疾病預(yù)防控制中心，SCXK(鄂)2013-0005).動物實驗和處理均遵照國際《The Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals》.

2 方法

2.1 DRG細胞分離和培養(yǎng)

大鼠飼養(yǎng)2d后脫頸處死，解剖取大鼠脊椎，沿經(jīng)椎間孔剪開，暴露脊髓，鏡下用鑷子摘取DRG細胞放入冰冷的Hanks液.用膠原酶II/胰蛋白酶消化，吹打成單細胞懸浮液，接種于10%馬血清 +DMEM培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)5d.

2.2 免疫熒光和免疫酶法標(biāo)記P物質(zhì)和NK-1R

熒光標(biāo)記:DRG細胞培養(yǎng)5d后，用4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.3%過氧化氫除去內(nèi)源性酶，正常山羊血清室溫封閉30 min，再滴加一抗P物質(zhì)1︰100，NK-1R 4℃過夜，次日滴加二抗FITC標(biāo)記羊抗兔 IgG 1︰1000，避光孵育40 min，封片觀察.

DAB標(biāo)記:用4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.3%過氧化氫除去內(nèi)源性酶，檸檬酸微波抗原修復(fù)，正常山羊血清室溫封閉30 min，再滴加一抗P物質(zhì)1︰100，NK-1R 1︰100 4℃孵育過夜，次日滴加聚合HRP的羊抗兔IgG 30 min，DAB顯色，鏡下控制發(fā)色時間，水溶性封片觀察.

2.3 免疫熒光-酶雙重染色標(biāo)記P物質(zhì)和NK-1R

DRG細胞培養(yǎng)5d后，4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.3%過氧化氫除去內(nèi)源性酶，正常山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗MAP-2 1︰200，4℃孵育過夜，次日先進行檸檬酸抗原修復(fù)，再滴加一抗P物質(zhì)抗體1︰100，4℃孵育過夜后，先滴加聚合HRP羊抗兔IgG，孵育30 min，再滴加FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG，DAB顯色，水溶性封片觀察.

MAP-2和NK-1R、GFAP和 NK-1R，S100和 NK-1R雙重染色操作步驟如上.

3 結(jié)果

3.1 DRG神經(jīng)元活細胞生長狀態(tài)觀察

DRG細胞培養(yǎng)5d后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)如圖1.由圖1可見，DRG神經(jīng)細胞大量生長，胞體較大呈圓形或橢圓形，明顯可辨，折光性好，光暈強;施萬細胞分枝明顯延長并增粗，呈兩端帶有突起的梭形;神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得稠密;成纖維細胞則為不規(guī)則的多角形，數(shù)量較多.

圖1 DRG神經(jīng)細胞Fig.1 The DRG cells of neurons

3.2 免疫熒光法和免疫酶法染色定位DRG細胞中P物質(zhì)和NK-1R

通過免疫熒光法和免疫酶法定位原代培養(yǎng)的DRG細胞中P物質(zhì)及NK-1R的表達，效果不佳.免疫熒光法(圖2a，2c)中雖紅色和綠色陽性標(biāo)記與黑色背景對比較明顯，但無法辨識DRG細胞結(jié)構(gòu)，且P物質(zhì)和NK-1R表達定位不清晰.免疫酶法(圖2b，2d)中細胞結(jié)構(gòu)相對比較清晰，但標(biāo)記物區(qū)分度不強，且背景著色較深，會對P物質(zhì)及NK-1R陽性結(jié)果的判定產(chǎn)生一定的干擾.

圖2 免疫熒光法和免疫酶法分別染色的DRG細胞Fig.2 DRG cells stained by immunofluorescence and immunoenzyme staining

3.3 免疫熒光-酶雙重染色定位P物質(zhì)和NK-1R

結(jié)合免疫酶聯(lián)法和免疫熒光法各自的優(yōu)勢，彌補二者的缺陷，便于觀察免疫染色結(jié)果和定性半定量分析，本文在原代培養(yǎng)的DRG細胞中實現(xiàn)了免疫熒光-酶雙重染色.

3.3.1 P物質(zhì)和MAP-2免疫熒光-酶雙重染色

用P物質(zhì)抗體和MAP-2抗體(標(biāo)記DRG神經(jīng)元)進行免疫熒光-酶雙重染色，獲得了比較好的效果，結(jié)果見圖3.圖3(a～c)分別為鏡下明場、熒光拍攝和明場熒光疊加的DRG細胞.由圖3(a)可見，SP呈陽性位于DRG神經(jīng)元中，圖3(b)中綠色熒光為神經(jīng)元的位置，圖3(c)中SP表達的陽性區(qū)域，神經(jīng)元也呈陽性，并可清楚地辨識細胞結(jié)構(gòu)，P物質(zhì)定位清晰，而免疫酶法和免疫熒光法分別染色無法實現(xiàn)P物質(zhì)準(zhǔn)確定位.由于P物質(zhì)免疫陽性區(qū)域位于中小型神經(jīng)元中，而不在非神經(jīng)細胞中，可知P物質(zhì)主要存在于DRG神經(jīng)元中，即P物質(zhì)主要由中小神經(jīng)元合成和釋放，與前期研究結(jié)果一致［5］.

圖3 免疫熒光-酶雙重染色定位的P物質(zhì)Fig.3 Substance P located by immunofluorescenceenzyme double staining

3.2.2 NK-1R 抗體和 MAP-2/GFAP/S100 免疫熒光-酶雙重染色

為驗證免疫熒光-酶雙重染色技術(shù)的穩(wěn)定性和可靠性，進一步獲得 NK-1R的位置信息，本文對NK-1R、DRG神經(jīng)元和非神經(jīng)元進行免疫熒光染色，其中對GFAP、S100抗體標(biāo)記的是DRG非神經(jīng)元，MAP-2抗體標(biāo)記的是神經(jīng)元，繼而定位了NK-1R和神經(jīng)元、非神經(jīng)元的位置關(guān)系，證明了NK-1R位于DRG神經(jīng)元內(nèi)，結(jié)果見如圖4.圖4(a～c)中顯示神經(jīng)元和NK-1R染色陽性區(qū)域幾乎重疊，說明NK-1R位于神經(jīng)元中;(d～f)和(g～i)中顯示DRG非神經(jīng)元和NK-1R染色陽性區(qū)域幾乎不存在重疊區(qū)域，說明NK-1R在DRG非神經(jīng)元中不存在.

圖4 免疫熒光-酶雙重染色定位的NK-1RFig.4 NK-1R located by immunofluorescenceenzyme double staining

4 討論

免疫組織化學(xué)染色方法中的免疫酶法和免疫熒光法在實驗藥理和病理研究中運用廣泛，經(jīng)歷了從單一標(biāo)記物到雙重標(biāo)記物甚至多重標(biāo)記物的發(fā)展歷程，為科學(xué)研究提供了重要的方法學(xué)支持.但免疫組織化學(xué)也存在諸多問題，尤其是免疫組織化學(xué)的質(zhì)量參差不齊，尚無明確的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［6］.對于單一標(biāo)記物免疫染色，何新明等［7，8］認為免疫組織化學(xué)技術(shù)受多步驟多環(huán)節(jié)多因素影響，存在誤判和誤診，如假陰性和假陽性.黃華偉［1］認為熒光抗體存在光穩(wěn)定性差、光漂白現(xiàn)象等嚴重問題.謝穎穎［9］研究了不同的固定及滲透方法對小鼠卵母細胞免疫熒光染色的影響.對于雙重免疫染色，路菊［10］認為兩個一抗的搭配和協(xié)調(diào)最重要.對于免疫酶法目前已實現(xiàn)多重酶標(biāo)記，但顯色物種類太多后，陽性標(biāo)記之間會產(chǎn)生串色，無法準(zhǔn)確判定陽性和陰性，顯色物濃度與時間難以把握，濃度過高或時間過長均會造成特異性染色深或假陽性，也可能增加背景染色［6］.

本文結(jié)合研究原代培養(yǎng)的DRG細胞中P物質(zhì)和NK-1R的定位，對比分析單獨使用免疫酶法和免疫熒光法染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫熒光法中紅色和綠色陽性標(biāo)記與黑色背景對比較明顯，但是無法辨識DRG細胞結(jié)構(gòu)，且P物質(zhì)和NK-1R表達定位不清晰.免疫酶法單一標(biāo)記中DRG細胞結(jié)構(gòu)比較清晰，但背景著色較深，會對P物質(zhì)和NK-1R陽性結(jié)果的判定產(chǎn)生一定的干擾.而本研究建立的免疫酶聯(lián)和免疫熒光的結(jié)合的酶聯(lián)-熒光雙重染色法中，既能清晰地辨明DRG細胞結(jié)構(gòu)，又可對標(biāo)記物清晰區(qū)分，避免了兩張切片上分別進行免疫酶法和免疫熒光法染色后再進行細胞定位和定性的統(tǒng)計學(xué)處理時出現(xiàn)的誤差和爭論，為實現(xiàn)對標(biāo)記物的定性和半定量分析提供了重要幫助.

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