邢詠梅，李紅蓮，郭順星

活性氧（ROS）存在于所有真核生物正常細(xì)胞代謝過(guò)程中，現(xiàn)已明確低濃度非致死性的活性氧可以作為細(xì)胞-信號(hào)通路的調(diào)節(jié)分子，調(diào)節(jié)各種生理過(guò)程[1]。作為真核細(xì)胞型微生物的真菌，其分化發(fā)育也與活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)。Egan 等[2]通過(guò)研究證實(shí)，真菌細(xì)胞中的活性氧與細(xì)胞的分化直接相關(guān)。植物病原真菌由菌絲形成菌核的機(jī)制一直倍受研究者們的關(guān)注。Georgiou[3]首先提出了真菌菌核的形成及分化與氧化應(yīng)激高度相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)了Sclerotium rolfsii 菌核的形成過(guò)程伴隨著高度的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生。在隨后的研究中，植物病原真菌菌核的形成被認(rèn)為是由氧化應(yīng)激觸發(fā)形成的[4]。生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧包括：過(guò)氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（）、羥自由基（·OH）、超氧自由基（·）等。藥用真菌豬苓菌絲形成菌核過(guò)程中是否伴隨 ROS 的變化以及抗氧化劑對(duì)豬苓菌絲形成菌核的影響值得探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 本實(shí)驗(yàn)所用豬苓采自山西古縣北平鎮(zhèn)黨家山村，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭順星研究員分離鑒定，保存于麥麩瓊脂培養(yǎng)基中。

1.1.2 試劑 麥芽糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、維生素 B1、瓊脂粉等購(gòu)自北京科百奧生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 SP-752 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)購(gòu)自上海光譜儀器有限公司；除菌濾器、微孔濾膜（孔徑 0.22 μm，直徑 13 mm）購(gòu)自北京科百奧生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基由麥芽糖 20.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂粉 15.0 g、去離子水1000 ml 配制而成。培養(yǎng)基在高壓滅菌前，將初始pH 調(diào)至 5.0。

1.2.2 抗氧化劑的添加 將維生素 C（Vc）溶解于去離子水中，配制成 100 mg/ml 的母液，母液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌后，將不同體積的 Vc母液分別加入到滅菌后冷卻至 60 ℃ 左右的麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基中，使 Vc 在培養(yǎng)基中的終濃度分別為 0.5、1.0、2.0、5.0、10 和 15 mg/ml。將 NADPH氧化酶抑制劑 apocynin（Apo）溶解于去離子水中并以超聲助溶，配制成 100 mmol/L 的母液，加入至滅菌后冷卻至 60 ℃ 左右的麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基中，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為 10、20、40 mmol/L。每組 30 個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。以不添加抗氧化劑的組為對(duì)照組，將培養(yǎng)基倒入直徑為 9 cm 的平皿中，每個(gè)平皿倒入 20 ml 培養(yǎng)基。

1.2.3 培養(yǎng)及接種方法 參照文獻(xiàn)[5-6]中培養(yǎng)豬苓的方法進(jìn)行。

1.2.4 觀察豬苓菌絲生長(zhǎng)及菌核形成情況 觀察豬苓菌絲在培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)情況。培養(yǎng) 60 d，用鑷子和手術(shù)刀片將豬苓菌核取出并稱取豬苓菌核鮮重，以不添加抗氧化劑的組為對(duì)照組，比較各組豬苓菌核形成的生物量情況。

1.2.5 NBT 還原法檢測(cè)豬苓菌核形成過(guò)程中菌絲及菌核活性氧含量 以不添加 Vc 的組為對(duì)照組，考察豬苓菌絲形成菌核過(guò)程中菌絲及菌核的活性氧含量以及抗氧化劑 Vc 對(duì)豬苓菌核發(fā)育過(guò)程中活性氧含量的影響。按照文獻(xiàn)[7]中方法進(jìn)行測(cè)定，將不同發(fā)育階段的豬苓菌絲或菌核樣本（0.1 g）與 1 ml 磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.8）充分混合后研磨勻漿（磷酸緩沖液中含有溶質(zhì) 0.1 mmol/L EDTA，0.3% w/v Triton X-100 及 4% w/v PVP聚乙烯吡咯烷酮），4 ℃ 條件下，15000×g 離心20 min 后取上清液 1 ml，加入 2 ml 0.05% 氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）與上清液反應(yīng) 10 min，4 ℃，15000×g，離心 20 min 后取上清液。在 85 ℃ 水浴中孵育 5 min，冷卻至室溫，于波長(zhǎng) 580 nm 處測(cè)定吸光度，吸光度的值與活性氧的含量成正比。每個(gè)樣品重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 抗氧化劑對(duì)豬苓菌絲生長(zhǎng)和菌核形成的影響

不同濃度 Vc 和 Apo 對(duì)豬苓菌核生物量的影響結(jié)果見(jiàn)表 1。培養(yǎng) 60 d，低濃度（0.5 mg/ml）的Vc 組（Vc-0.5）能夠促進(jìn)豬苓菌絲生長(zhǎng)并促使豬苓菌絲形成菌核，豬苓菌絲生長(zhǎng)旺盛，氣生菌絲發(fā)達(dá)（圖 1B），其菌核形成的生物量為不添加 Vc 的對(duì)照組的 1.09 倍，兩者之間的差異無(wú)顯著性（P ＞0.05）。濃度為 1.0 mg/ml 的 Vc 組(Vc-1)豬苓菌絲生長(zhǎng)旺盛，其菌核形成的生物量?jī)H為對(duì)照組的57%（圖 1C）；濃度為 2.0 mg/ml的 Vc 組（Vc-2）豬苓菌絲其菌核形成的生物量?jī)H為對(duì)照組的 29%；濃度為 5.0、10、15 mg/ml Vc 組（Vc-5、Vc-10、Vc-15）對(duì)豬苓菌絲生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用，隨著 Vc 濃度的升高，其對(duì)豬苓菌絲生長(zhǎng)抑制程度增強(qiáng)，Vc-5 組豬苓菌絲生長(zhǎng)較緩慢，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，外圍新生菌絲與接種處周圍生長(zhǎng)的菌絲之間有明顯的空隙（圖 1D）；Vc-15 組中的豬苓菌絲呈固縮狀生長(zhǎng)，氣生菌絲不發(fā)達(dá)（圖 1F）；Vc-5、Vc-10、Vc-15 組均不能使豬苓菌絲形成菌核。與不添加抗氧化劑的對(duì)照組相比，NADPH 氧化酶抑制劑 Apo（10、20、40 mmol/L）使豬苓菌絲生長(zhǎng)明顯減緩，并且不能誘導(dǎo)豬苓菌核形成。

表1 抗氧化劑對(duì)豬苓菌核形成的生物量的影響（）Table1 Effects of antioxidants on P.umbellatus sclerotia biomass ()

表1 抗氧化劑對(duì)豬苓菌核形成的生物量的影響（）Table1 Effects of antioxidants on P.umbellatus sclerotia biomass ()

注：*：P ＞ 0.05；**：P ＜ 0.05。Note: *: P ＞ 0.05; **: P ＜ 0.05.

組別（n = 30）Groups（n = 30）菌核生物量(g/20g 基質(zhì))Biomass of sclertia (g/20 g substrate)Vc-0（對(duì)照） Vc-0 (control) 1.55 ± 0.10 Vc-0.5 1.69 ± 0.06*Vc-1 0.88 ± 0.20**Vc-2 0.45 ± 0.08**Vc-5 0 Vc-10 0 Vc-15 0 Apo（10、20、40 mmol/L） 0

2.2 NBT 還原法檢測(cè)豬苓菌核形成過(guò)程中活性氧含量

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在培養(yǎng)的不同時(shí)相，以不添加 Vc 的 Vc-0 組豬苓菌絲內(nèi) ROS含量為最高，其次是 Vc-0.5 組，隨著 Vc 濃度的升高，豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量逐漸降低。各組從培養(yǎng)的 15 ～45 d，豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量呈逐漸增高的趨勢(shì)；當(dāng)培養(yǎng) 45 d 時(shí)，豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量達(dá)到最高，此時(shí)，Vc-0 組豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量?jī)H為 Vc-0.5組的 1.091 倍；Vc-0 組豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量為Vc-1 組的 1.315 倍，為 Vc-2 組的 1.757 倍，為Vc-5 組豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量的 2.76 倍，說(shuō)明高濃度的 Vc 在很大程度上消除了活性氧，而添加了低濃度的 Vc 組（0.5 mg/ml）對(duì)活性氧的清除作用并不明顯；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，豬苓菌絲內(nèi) ROS含量出現(xiàn)降低的趨勢(shì)并逐漸保持平穩(wěn)，結(jié)果見(jiàn)圖 2。

圖1 培養(yǎng) 60 d，抗氧化劑 Vc 對(duì)豬苓菌核形成的影響[A：未添加 Vc 的 Vc-0 組（對(duì)照組）；B：Vc-0.5 組；C：Vc-1 組；D：Vc-5 組；E：Vc-10 組；F：Vc-15 組]Figure1 Effect of antioxidants on P.umbellatus sclerotial formation after cultivation for 60 days (A: Control group without Vc; B:Vc-0.5 group with 0.5 mg/ml vitamin C; C: Vc-1 group with 1 mg/ml vitamin C; D: Vc-5 group with 5 mg/ml vitamin C; E: Vc-10 group with 10 mg/ml vitamin C; F: Vc-15 group with 15 mg/ml vitamin C)

圖2 抗氧化劑 Vc 對(duì)豬苓菌絲形成菌核過(guò)程中活性氧含量的影響Figure2 Effects of antioxidants on ROS content during sclerotial formation directly from mycelia

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，植物病原菌 S.rolfsii 菌核形成和分化過(guò)程中伴隨著高水平的氧化應(yīng)激[3]；抗氧化劑的應(yīng)用能夠抑制 S.rolfsii、Rhizoctonia solani、Sclerotinia minor 以及 Sclerotinia sclerotiorum 菌核的形成和分化[8-9]。生物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與抗氧化防御功能之間的平衡發(fā)生紊亂造成了氧化應(yīng)激狀態(tài)的形成[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的 Vc（0.5 mg/ml）能夠促進(jìn)豬苓菌絲生長(zhǎng)并促使豬苓菌絲形成菌核；雖然低濃度的 Vc 能夠部分的抵消豬苓菌絲及菌核活性氧的含量，但與不添加 Vc 的對(duì)照組相比，兩組中的豬苓菌絲的活性氧含量十分接近，說(shuō)明兩組中菌絲內(nèi)的氧化應(yīng)激水平接近，因此，對(duì)豬苓菌核形成的生物量無(wú)顯著性差異。隨著 Vc 濃度的增加，豬苓菌絲內(nèi)活性氧的含量逐漸下降，當(dāng) Vc 濃度為5.0、10、15 mg/ml 時(shí)，豬苓菌絲不能形成菌核，可能與豬苓菌絲內(nèi)的活性氧的含量過(guò)低，導(dǎo)致菌絲內(nèi)的氧化應(yīng)激水平過(guò)低有關(guān)。因此，豬苓菌絲形成菌核過(guò)程中伴隨活性氧的迸發(fā)，豬苓菌絲內(nèi)氧化應(yīng)激達(dá)到一定的水平時(shí)才可能促使豬苓菌絲向菌核分化。然而，豬苓菌絲形成菌核的過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的多因素綜合作用的結(jié)果，各種理化因子及生物調(diào)控因子共同參與其中，有關(guān)豬苓菌絲形成菌核的分子生物學(xué)機(jī)制的研究正在進(jìn)一步的探討中。我們期待在以后的研究中有新的發(fā)現(xiàn)，為深入探討豬苓菌絲形成菌核機(jī)制的研究提供重要的理論基礎(chǔ)。

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