張穎華，嚴(yán)玉潔，方紅，歐陽(yáng)霖，嚴(yán)謹(jǐn)，趙燕萍

隨著社會(huì)人口老齡化的加劇，慢性病越來(lái)越成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題和科學(xué)研究的重點(diǎn)。閔行區(qū)常住人口242.94 萬(wàn)，納入閔行區(qū)居民電子健康信息檔案的糖尿病患者 51379 例，高血壓患者 184266 例，腫瘤患者 20000 例。在慢性病的防治中，公共衛(wèi)生研究人員對(duì)慢性病患者生物樣本的需求量也大為上升，因此慢性病生物樣本庫(kù)的建立就成為擺在我們面前的一個(gè)緊急而重要的任務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 MDF-U73V 立式 –80 ℃ 冰箱和 MDF-C8V臥式 –80 ℃ 冰箱為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；BP-IP-300 型標(biāo)簽打印機(jī)為美國(guó) Brady 公司產(chǎn)品；5720R 型低溫離心機(jī)為德國(guó) Eppendorf 公司產(chǎn)品；UA-C15 型轉(zhuǎn)運(yùn)箱為北京福意聯(lián)公司產(chǎn)品；EPS-100 型電泳儀和 Fine-do X5 型凝膠成像系統(tǒng)為上海天能公司產(chǎn)品。

1.1.2 耗材 10×10 專(zhuān)用凍存盒、4×8 抽屜凍存架和0.5 ml 凍存管為上海萬(wàn)格科學(xué)器材有限公司產(chǎn)品；低溫標(biāo)簽和標(biāo)簽色帶為美國(guó) Brady 公司產(chǎn)品；5 ml 塑料離心管為江蘇浩天生物器材制造廠生產(chǎn)；5 ml 抗凝采血管和非抗凝采血管購(gòu)自武漢致遠(yuǎn)醫(yī)療科技有限公司。

1.1.3 軟件 凍存管理軟件購(gòu)自杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司；溫度管理軟件和無(wú)線采集模塊為上海萬(wàn)格科學(xué)器材有限公司開(kāi)發(fā)；無(wú)線數(shù)據(jù)接口購(gòu)自杭州創(chuàng)業(yè)軟件股份有限公司。

1.1.4 試劑 全血總 DNA 提取試劑盒購(gòu)自廣州 Magen公司；瓊脂糖凝膠和 λDNA/Hind III 分子標(biāo)記為日本Takara 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集對(duì)象 經(jīng)閔行區(qū)疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，以江川社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心為試點(diǎn)，隨機(jī)抽取60 歲以上老年體檢人群，收集前培訓(xùn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心體檢工作人員和標(biāo)本庫(kù)現(xiàn)場(chǎng)采集人員，保證現(xiàn)場(chǎng)工作的一致和準(zhǔn)確，并事先在居委會(huì)做好體檢登記核對(duì)。

1.2.2 基線調(diào)查 利用閔行區(qū)現(xiàn)有的居民電子健康信息系統(tǒng)（electronic health record，EHR）進(jìn)行基線調(diào)查。該系統(tǒng)主要由閔行區(qū)衛(wèi)生數(shù)據(jù)中心系統(tǒng)（包括數(shù)據(jù)交換中心、區(qū)級(jí)居民健康檔案信息系統(tǒng)），社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)信息系統(tǒng)（全科診療、高血壓糖尿病等慢性病管理、婦女保健管理、兒童保健管理、計(jì)劃免疫、腫瘤早發(fā)現(xiàn)、體檢系統(tǒng)）等模塊組成。其中慢性病管理模塊包含被管理對(duì)象的基本信息、生活方式、危險(xiǎn)因素、臨床診斷結(jié)果等大量可供分析的變量。經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心人員統(tǒng)一輸入居民 EHR 系統(tǒng)，醫(yī)生對(duì)體檢人員做知情告知，體檢者簽署知情同意書(shū)后，刷個(gè)人健康卡。

1.2.3 樣本采集及入庫(kù)

1.2.3.1 標(biāo)本條形碼設(shè)置 體檢者刷其持有的閔行區(qū)健康卡，生成體檢編號(hào)，如 J000001。對(duì)于已簽署知情同意的體檢者在其體檢套餐中勾選打印現(xiàn)場(chǎng)體檢編號(hào)，貼于抗凝管和非抗凝管上，這個(gè)標(biāo)簽信息是“暫時(shí)”的，此標(biāo)簽編碼是標(biāo)記原始采血管的編碼，用于識(shí)別此采血管為哪個(gè)招募對(duì)象的標(biāo)本。

1.2.3.2 樣本采集 用事先打印好的具有唯一身份標(biāo)識(shí)的條形碼標(biāo)簽分別貼于知情同意書(shū)、EDTA 管和血清管。抽取體檢者的血液標(biāo)本，用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)試管收集 1 管抗凝血，1 管非抗凝血（抗凝劑 EDTA，血量均保持在 5 ml 以上），現(xiàn)場(chǎng)于 4 ℃ 冰箱保存，4 h 內(nèi)經(jīng) 4 ℃ 冷鏈運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，抗凝血標(biāo)本直接分裝到每個(gè)凍存管中，非抗凝血標(biāo)本 5994× g 離心 10 min，吸取上清分裝到凍存管中。

1.2.3.3 樣本入庫(kù) 貼有紙質(zhì)條碼標(biāo)簽的采血管分別離心后于特制管架上排序，分裝標(biāo)本核對(duì)采集信息。二維碼打印機(jī)設(shè)置 IP 地址，通過(guò)應(yīng)用程序客戶端發(fā)送打印指令給打印機(jī)，打印一組耐 –80 ℃ 低溫的二維碼標(biāo)簽。其中血清 3 管（綠色管，編號(hào) S），全血 3 管（橘色管，編號(hào) WB），共6 張條碼分別貼于相應(yīng)分色的 EP 管上，此標(biāo)簽信息是“長(zhǎng)期”的，通過(guò)中心實(shí)驗(yàn)室二維條碼掃描器及網(wǎng)絡(luò)條碼識(shí)別完成標(biāo)本的入庫(kù)及標(biāo)本相關(guān)信息的導(dǎo)入，標(biāo)本轉(zhuǎn)入 –80 ℃ 冰箱長(zhǎng)期保存。

1.2.4 樣本信息和 EHR 信息對(duì)接 閔行區(qū)每個(gè)持有健康卡的對(duì)象均有一個(gè)由 0～9 組成的 20 位編號(hào)的固定且唯一的個(gè)人編碼。標(biāo)本管理軟件通過(guò)數(shù)據(jù)接口，根據(jù)個(gè)人編碼，借助局域網(wǎng)與 EHR 中相應(yīng)信息字段預(yù)先進(jìn)行關(guān)聯(lián)。當(dāng)在實(shí)驗(yàn)室掃描標(biāo)本二維碼時(shí)自動(dòng)從 EHR 獲取對(duì)應(yīng)的信息項(xiàng)目，并自動(dòng)載入到標(biāo)本信息列表中，實(shí)現(xiàn)了信息與標(biāo)本同時(shí)入庫(kù)。標(biāo)本入庫(kù)后再通過(guò)個(gè)人編碼建立數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，將體檢結(jié)果、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果等從HIS、LIS 導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)。為保證信息安全標(biāo)本管理軟件應(yīng)設(shè)置相應(yīng)權(quán)限。

1.2.5 血樣本質(zhì)量控制 按比例隨機(jī)抽取 100 份儲(chǔ)存于低溫冰箱的抗凝血樣本，室溫融化后，用 HiPure blood DNA mini kit 進(jìn)行抽提。取 3 μl 純化的 DNA，點(diǎn)樣于 0.8% 瓊脂糖凝膠，80 V 電泳 30 min 后拍照。

2 結(jié)果

2.1 初步建立了慢性病研究樣本庫(kù)

2012年 5月開(kāi)始收集標(biāo)本，募集對(duì)象為上海閔行江川地區(qū) 60 歲以上居民。目前共招募 10115 人，其中男性4137 人（40.90%），女性 5978 人（59.10%），平均年齡值為 65.15 歲，明確為高血壓的患者 5557 人，糖尿病患者1869 人。共收集 60690 份標(biāo)本，其中血清 30310 份，全血 30380 份。

2.2 慢性病生物樣本庫(kù)收集的數(shù)據(jù)信息

信息數(shù)據(jù)庫(kù)主要分為個(gè)人基本信息，流行病學(xué)信息（生活史、家族史、危險(xiǎn)因素），臨床診斷信息（血尿常規(guī)、影像檢查、特殊檢查），隨訪記錄，用藥情況等，共 94 個(gè)字段，詳見(jiàn)表 1。

2.3 血樣本質(zhì)控結(jié)果

抗凝血基因組 DNA 的部分電泳圖譜見(jiàn)圖 1，結(jié)果表明，所有質(zhì)控樣本的 DNA 帶型單一、完整、不降解。

3 討論

建立生物樣本庫(kù)是一個(gè)系統(tǒng)工程，它是系統(tǒng)地、有目的地收集特定人群的生物樣本，以備“將來(lái)”的研究。這個(gè)“將來(lái)”，可能沒(méi)有具體的時(shí)限，因此標(biāo)本需要長(zhǎng)期保存。生物樣本庫(kù)的建設(shè)包括硬件設(shè)施與保障、樣本操作規(guī)程、信息管理系統(tǒng)、倫理委員會(huì)、樣本的利用及共享機(jī)制等。

目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了用于慢性病研究的樣本庫(kù)[1-5]，但閔行區(qū)尚無(wú)。此慢性病生物樣本庫(kù)以江川社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心為試點(diǎn)，摸索生物樣本庫(kù)的建設(shè)流程、倫理問(wèn)題、軟件對(duì)接、標(biāo)本采集存儲(chǔ)以及生物樣本庫(kù)的應(yīng)用等諸多環(huán)節(jié)，在此基礎(chǔ)上建成覆蓋閔行區(qū)全人群的慢性病生物樣本庫(kù)。

我國(guó)生物標(biāo)本庫(kù)存在的問(wèn)題主要有以下幾點(diǎn)：標(biāo)本收集不規(guī)范、保存不完善、流行病學(xué)資料缺乏或缺失等。一個(gè)較好的生物樣本庫(kù)是建立在高質(zhì)量的標(biāo)本和全面的標(biāo)本信息基礎(chǔ)上的，使用缺乏質(zhì)控或信息缺乏的標(biāo)本而發(fā)表的文獻(xiàn)所造成的負(fù)面影響將要花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間來(lái)消除[6]。涵蓋豐富流行病學(xué)信息和臨床診斷信息的閔行區(qū) EHR 信息系統(tǒng)為慢性病生物樣本庫(kù)的建設(shè)提供了一個(gè)優(yōu)越的先決條件，它涵蓋了“基本醫(yī)療”、“高血壓管理”、“糖尿病管理”、“腫瘤早期篩查”等業(yè)務(wù)模塊。目前閔行區(qū)高血壓和糖尿病患者管理人數(shù)分別占上海全市 11.84% 和 12.57%；重大疾病的高危和疑似人群能通過(guò) EHR 及時(shí)篩選出來(lái)。被管理對(duì)象在醫(yī)院的每一個(gè)就醫(yī)環(huán)節(jié)，包括用藥信息都被準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)地輸入到系統(tǒng)里，這一涵蓋了豐富的流行病學(xué)信息的 EHR 系統(tǒng)在國(guó)內(nèi)處于領(lǐng)先水平，使更多有價(jià)值的研究成為可能。同時(shí)閔行區(qū)高血壓規(guī)范管理率為 92.01%，糖尿病規(guī)范管理率 96.09%，居上海市前列，這為創(chuàng)建慢性病科研平臺(tái)標(biāo)本庫(kù)提供了較為扎實(shí)的標(biāo)本資源，固定、易隨訪保證了相關(guān)信息資源和標(biāo)本資源完整性。但同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，體檢人群的流行病學(xué)信息還有缺失，為了完善這部分關(guān)鍵內(nèi)容，我們擬在下一步的工作中培訓(xùn)社區(qū)醫(yī)生，提高流行病信息的完整性以及體檢人群的依從性；其次收集的臨床診斷數(shù)據(jù)中還存在一些不能量化的變量，比如說(shuō)一些臨床檢查結(jié)果的描述是文本型的，如何把這些字段量化也是今后一段時(shí)間內(nèi)亟需改進(jìn)的地方。

樣本庫(kù)建設(shè)的另外一個(gè)重要的方面是樣本信息和采樣對(duì)象的流行病學(xué)信息的一一對(duì)應(yīng)，這就對(duì)標(biāo)本管理軟件和信息軟件的接口提出了更高的要求，操作方便，設(shè)置靈活的管理軟件以及高質(zhì)量的數(shù)據(jù)接口能減少出錯(cuò)幾率，保證樣本信息的準(zhǔn)確性。

表1 慢性病生物樣本庫(kù)收集的數(shù)據(jù)信息

圖1 部分樣品的 DNA 電泳圖譜

綜上所述，本項(xiàng)目通過(guò)采集、保存和利用人類(lèi)慢性病的生物標(biāo)本，結(jié)合閔行區(qū) EHR 信息將社區(qū)居民慢性病管理資料與標(biāo)本庫(kù)有機(jī)結(jié)合起來(lái)，如本項(xiàng)目中把每個(gè)入選對(duì)象的流行病學(xué)信息和收集的標(biāo)本信息一一對(duì)應(yīng)，建立了實(shí)時(shí)、安全、有較高研究?jī)r(jià)值的慢性病生物樣本庫(kù)，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)本信息資源的共享，使得慢性病研究平臺(tái)標(biāo)本庫(kù)能更好地滿足科研和疾病防控需要。

慢性病生物樣本是極其稀缺和寶貴的遺傳資源，建立慢性病生物樣本庫(kù)不僅能有效地利用有限的慢性病標(biāo)本，為人類(lèi)直接探究慢性病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供具體研究對(duì)象，縮短研究周期，加快研究進(jìn)程，早出成果，同時(shí)標(biāo)本庫(kù)的建立能有效加強(qiáng)高校和科研機(jī)構(gòu)之間的相互合作，有效提高慢性病研究水平，將更為有利于慢性病研究的發(fā)展。

同時(shí)我們也意識(shí)到建立一個(gè)高質(zhì)量、規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)化慢性病生物樣本庫(kù)仍是一個(gè)新的課題，如何確保標(biāo)本長(zhǎng)期保存的質(zhì)量[7]，如何建立好標(biāo)本采集、保存、信息化管理和研究于一體的科學(xué)管理體系，如何解決樣本收集過(guò)程中的倫理問(wèn)題，如何最大限度地利用好生物樣本庫(kù)[8]，有效地保護(hù)和利用好人群的遺傳資源等，這些問(wèn)題都需要我們進(jìn)一步去研究解決。

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