劉 欣 王炳勝 劉秀芳 張 海 李鳳玉 張建宇 葛艷麗 李衛(wèi)威

（1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；2.解放軍第二五一醫(yī)院，河北 張家口 075000）

數(shù)字化基因表達(dá)譜（Digital Gene Expression Profile）是利用新一代高通量測(cè)序和高性能的計(jì)算機(jī)分析技術(shù)，全面、經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)某一特定組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)情況，這一技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)病機(jī)制、藥物研發(fā)等研究領(lǐng)域。研究表明，益氣活血方能夠降低放射性損傷相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，降低其發(fā)生率，減輕其癥狀持續(xù)時(shí)間［1-4］，是腫瘤放化療患者良好的輔助用藥，但其作用的分子機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)采用數(shù)字化基因表達(dá)譜分析益氣活血方對(duì)大鼠肺組織基因表達(dá)的影響，從而了解益氣活血方作用的分子機(jī)制，為該藥在臨床上推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 20只健康雌性成年Wistar大鼠20只，體質(zhì)量（200±20） g，許可證號(hào) scxk（京 2012-0001），合格證號(hào)026150，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3 d，無(wú)異常者入組者實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑及儀器 主要試劑為Illumina Gene Expression Sample Prep Kit和Illumina測(cè)序芯片（flow-cell）；主要儀器為Illumina Cluster Station和Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)。

1.3 藥物 益氣活血方，組方：黃芪30 g，黨參25 g，白術(shù) 15 g，茯苓 15 g，丹參 30 g，雞血藤 30 g，地龍 15 g，川芎 15 g，當(dāng)歸 20 g，苦參 30 g，香附 30 g，麥冬 15 g，枇杷葉15 g，紫金牛10 g。藥材水煎、醇沉、濃縮、分裝、消毒備用，生藥含量2 g／mL。

1.4 分組與造模 將大鼠隨機(jī)分為益氣活血方組10只（中藥組）、空白對(duì)照組10只（對(duì)照組）。中藥組大鼠每日灌胃益氣活血方1 mL，對(duì)照組每日灌胃蒸餾水1 mL，直至動(dòng)物被處死取材。

1.5 標(biāo)本采集 兩組大鼠分別于首次灌胃起第6、12周末，各隨機(jī)抽取5只，用戊巴比妥鈉0.04 g/kg腹腔麻醉后立即開(kāi)胸取其右肺組織，并保存于-80℃冰箱備用。

1.6 數(shù)字化基因表達(dá)譜信息分析流程

1.6.1 Tag的制備 提取 6 μL總 mRNA，利用Oligo（dT）磁珠吸附純化 mRNA，并以 Oligo（dT）引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。采用四堿基識(shí)別酶NlaⅢ，識(shí)別并切斷cDNA上的CATG位點(diǎn)，利用磁珠沉淀純化帶有cDNA 3'端的片段，將其5'末端連接Illumina接頭1。利用MmeI酶切CATG位點(diǎn)下游17 bp處，通過(guò)磁珠沉淀去除3'片段后，在Tag3'末端連接Illumina接頭2，從而獲得兩端連有不同接頭序列的21 bp標(biāo)簽library。經(jīng)過(guò)15個(gè)循環(huán)的PCR線性擴(kuò)增后，通過(guò)6%TBEPAGE膠電泳純化95堿基條帶，解鏈后，單鏈分子被加到Illumina測(cè)序芯片（flowcell）上并固定，每條分子經(jīng)過(guò)原位擴(kuò)增成為一個(gè)單分子簇 （cluster）測(cè)序模板，加入4色熒光標(biāo)記的4種核苷酸，采用邊合成邊測(cè)序法（SBS）測(cè)序。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)basecalling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，稱(chēng)為原始Tag。

1.6.2 Clean Tag 原始序列帶有一段3'adaptor序列，并且含有少量低質(zhì)量序列以及各種雜質(zhì)成分。經(jīng)過(guò)一系列數(shù)據(jù)處理，得到Clean Tag。

1.6.3 基因表達(dá)注釋 經(jīng)過(guò)測(cè)序質(zhì)量評(píng)估、測(cè)序飽和度分析、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性分析、Cleantag拷貝數(shù)分布統(tǒng)計(jì)、Clean Tag比對(duì)統(tǒng)計(jì)等一系列處理后對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行注釋。

1.6.4 差異基因的篩選 參照文獻(xiàn)［5］的數(shù)字化基因表達(dá)譜差異基因檢測(cè)方法，開(kāi)發(fā)了嚴(yán)格的算法篩選兩樣本間的差異表達(dá)基因。在本次分析中，差異表達(dá)基因定義為FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因。通過(guò)對(duì)Gene Ontology功能顯著性富集分析、Pathway顯著性富集分析、差異基因表達(dá)模式聚類(lèi)分析等一系列后續(xù)處理后得出結(jié)果。通過(guò)GO功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生學(xué)功能。

2 結(jié) 果

中藥組對(duì)比對(duì)照組在6周末差異表達(dá)基因?yàn)?338個(gè)，其中上調(diào)基因?yàn)?05個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?33個(gè)。以corrected-pvalue≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，找出顯著富集的GO條目，發(fā)現(xiàn)這些基因主要和細(xì)胞代謝過(guò)程相關(guān)。通過(guò)差異基因表達(dá)模式聚類(lèi)分析得出：6周末上調(diào)基因主要與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)，下調(diào)基因主要與脂代謝、炎癥因子相關(guān)。12周末差異表達(dá)基因?yàn)?001個(gè)，其中上調(diào)基因?yàn)?55個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?226個(gè)。以correctedpvalue≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，找出顯著富集的GO條目，發(fā)現(xiàn)這些基因主要應(yīng)激反應(yīng)、免疫過(guò)程、細(xì)胞代謝過(guò)程的調(diào)控相關(guān)。通過(guò)差異基因表達(dá)模式聚類(lèi)分析，筆者得出上調(diào)基因主要與免疫、DNA損傷修復(fù)相關(guān)，下調(diào)基因主要與脂代謝、炎癥因子、纖維化功能相關(guān)。從中找出特異性差異表達(dá)基因，見(jiàn)表1、表2。

表1 6周末差異表達(dá)基因

表2 12周末差異表達(dá)基因

3 討 論

益氣活血方是由筆者經(jīng)過(guò)多年的臨床實(shí)踐研制出來(lái)的具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、活血化瘀等功效的方劑，主要用于防治輻射損傷。藥理研究表明，當(dāng)歸、川芎能對(duì)抗輻射損傷；黃芪具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基的作用［6］；黨參能夠上調(diào)細(xì)胞外超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的表達(dá)［7］；丹參具有抗血小板聚集、改善微循環(huán)等作用；苦參能抑制成纖維細(xì)胞的增殖活力及DNA合成［8］；香附、當(dāng)歸、川芎、地龍具有提高機(jī)體免疫力、非特異性抗炎等作用［9］。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2可以誘導(dǎo)新生血管的形成［10］，能夠促進(jìn)骨組織、軟骨組織及神經(jīng)組織損傷修復(fù)和再生［11］。中藥組大鼠肺組織在給藥后6周及12周均有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白的高表達(dá)，間接表明益氣活血方可以通過(guò)增加成纖維細(xì)胞因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。

腫瘤壞死因子是一種多功能的細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)免疫及炎癥反應(yīng)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)的早期炎癥反應(yīng)及晚期肺纖維化是放射性肺損傷發(fā)生的主要機(jī)制［1］。中藥組大鼠肺組織在給藥6周、12周時(shí)均有腫瘤壞死因子受體基因、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白基因的下調(diào)，表明益氣活血方可以減輕減少輻射損傷相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，降低血液黏稠度，從而減輕炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)。

XRCC5及XRCC6均是DNA損傷修復(fù)基因，XRCC5是修復(fù)DNA雙鏈斷裂的基因，放射線照射后XRCC5的mRNA高表達(dá)［12］，輻射抗性小鼠高表達(dá)XRCC5基因［13］。益氣活血方應(yīng)用 12周后可以使 XRCC5、XRCC6基因高表達(dá)，表明該藥可以提高大鼠的抗輻射能力，從而減輕輻射損傷。

白介素-17（IL-17）可以刺激粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的分泌，介導(dǎo)免疫系統(tǒng)和造血之間的相互作用，并能夠刺激白介素-6和前列腺素-E2的產(chǎn)生，加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)［14］。白介素-22（IL-22）在炎癥與免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，有研究表明在急性泛發(fā)性發(fā)疹膿包病中外周血中的IL-22和IL-17表達(dá)量明顯提高，它們共同刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生白介素-8從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞在急性泛發(fā)型膿皰表皮中聚集［15］。益氣活血方應(yīng)用12周時(shí)IL-17受體基因、IL-22受體基因下調(diào)，表明益氣活血方可以調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)因子的基因表達(dá)，從而減輕放射性損傷。

層黏連蛋白可以結(jié)合多種整合素及膠原蛋白，與纖維化形成有關(guān)。益氣活血中藥應(yīng)用12周后可以降低整合蛋白α及層黏連蛋白基因的表達(dá)，表明益氣活血方能預(yù)防纖維化的形成。

綜上所述，益氣活血方可以調(diào)控脂代謝、炎癥因子、免疫功能、DNA損傷修復(fù)、纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，加強(qiáng)細(xì)胞增殖及分裂，降低血液粘稠度，改善微循環(huán)，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。長(zhǎng)期應(yīng)用可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，降低炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，并提高機(jī)體抗輻射能力，有一定的抗纖維化作用。這也是該方具有降低放射性肺損傷發(fā)生率，減輕放射性肺損傷，改善患者臨床癥狀及其持續(xù)時(shí)間的分子生物學(xué)機(jī)理。

［1］王炳勝，劉秀芳，張海，等.中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤放射損傷［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：65.

［2］王炳勝，呂國(guó)士，張海，等.益氣活血養(yǎng)陰方對(duì)放射性肺損傷的影像療效觀察［J］.中國(guó)肺癌雜志，2007，10（3）：240-242.

［3］劉秀芳，李鳳玉，王炳勝，等.益氣活血中藥對(duì)肺癌放療患者肺功能的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（8）：16.

［4］雒書(shū)朋，王炳勝，王麗玲，等.益氣活血養(yǎng)陰方對(duì)放射性肺損傷劑量體積直方圖的分析［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2008，17（6）：738.

［5］Sutherland BM，Georgakilas AG，Bennett PV，et al.Quanitifying clustered DNA damage induction and repair by gel electrophoresis，electronic imaging and number average length analysis［J］.Mutat Res，2003，531（1-2）：93-107.

［6］王要軍，權(quán)啟鎮(zhèn)，孫自勤，等.黃芪對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化組織ICAVI-I表達(dá)影響的免疫組化研究 ［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)雜志，2000，5（1）：49-51.

［7］權(quán)循鳳，張帆，孔令玲.丹參防治放射性肺損傷的臨床觀察［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（6）：456-458.

［8］木海鷗，蘇孝共.地龍的藥理研究概要［J］.中國(guó)藥業(yè)，2007，16（1）：61-62.

［9］黃險(xiǎn)峰，彭國(guó)平.香附的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］.中藥材，2003，26（1）：65-68.

［10］Ng EW，Adam is AP.Targeting angiogenesis，the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration［J］.Can J Ophthalmol，2005，40（3）：352-368.

［11］Nakae M，Kamiya H，Naruse K，et al.Effects of basic fibroblast growth factor on experimental diabetic neuropathy in rats［J］.Diabetes，2006，55：1470-1477.

［12］王芹，岳井銀，李進(jìn)，等.γ射線照射后小鼠XRCC修復(fù)基因的 mRNA 表達(dá)［J］.中國(guó)輻射衛(wèi)生，2006，15（1）：1-2.

［13］郭萬(wàn)峰.應(yīng)用基因芯片篩選肺癌細(xì)胞輻射增敏分子靶標(biāo)的研究［D］.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2005.

［14］Schwarzenberger P，Huang W，Ye P，et al.Requirement of endogenous stem cell factor and granulocyte-colony-stimulating factor for IL-17-mediated granulopoiesis［J］.J Immunol，2000，164 （9）：4783-4789.

［15］Kabashima R，Sugita K，Sawada Y，et al.Increased circulating Th17 frequencies and serum IL-22 levels in patients with acute generalized exanthematous pustulosis［J］.J Euracad Dermatol Venereol， 2010，25（12）：135-137.