劉小輝，李祥龍，2* ，周榮艷，李蘭會，張 天，王建濤

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北科技師范學(xué)院 動物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066000；3.唐山市畜牧工作站，河北 唐山 063004)

Dock7是毛色相關(guān)基因，已經(jīng)被克隆，具有色素減退作用且對發(fā)育具有重要作用，在小鼠的腹部、爪子、尾部缺少色素而使局部出現(xiàn)白色，但是在體外培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞出現(xiàn)色素沉著過度[1]。Dock7基因在多種組織中表達(dá)，作為一種鳥苷酸交換因子，通過催化結(jié)合GDP與自由GTP之間的交換特異激活Rac1和Rac3，鳥嘌呤核苷酸交換因子參與將跨膜受體和細(xì)胞內(nèi)GTPase家族成員聯(lián)系起來的信號通路，從而調(diào)控許多細(xì)胞作用，如細(xì)胞增殖分化黏附凋亡等[2]，研究證實(shí)，Rac1在細(xì)胞的遷移黏附等方面發(fā)揮重要作用[3]。由于替換與剪切使得Dock基因存在多種亞型，本文利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法研究了Dock7 基因編碼區(qū)種間和種內(nèi)變異，從而探明該基因在不同種間及種內(nèi)的遺傳分化，進(jìn)而為相關(guān)黑色素基因的遺傳學(xué)和進(jìn)化分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

從NCBI 網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的GenBank 中下載人、倭黑猩猩、大猩猩、毛猩猩、東非狒狒、玻利維亞的灰鼠猴子、虎鯨、家馬、白犀牛、雪貂、家牛、大熊貓、佛羅里達(dá)海牛、海象、歐洲兔、家貓、家綿羊、星鼻鼴鼠、北美鼠兔、裸鼢鼠、非洲跳鼠、八齒鼠、褐家鼠、小家鼠、袋獾、原雞、爪蟾27個物種68條Dock7 基因的CDS序列，68個基因序列的登錄號見表1。

1.2 方 法

將序列下載后，首先利用BioEdit軟件對下載的27個物種的68條Dock7 基因CDS 序列進(jìn)行比對分析，選取所有序列共有片段(長度為4 551 bp )進(jìn)行比較，然后利用DnaSP 5.10軟件對其進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，生成單倍型，得出平均核苷酸差異數(shù)(k)、核苷酸歧異度(Dxy)、遺傳分化指數(shù)(Gst)、凈遺傳距離(Da)、密碼子偏愛性和同義替換位點(diǎn)數(shù)(SS)、非同義替換位點(diǎn)數(shù)(NSS)、G+C含量。利用MEGA4.0軟件的UPGMA方法構(gòu)建聚類圖，進(jìn)行聚類分析。再利用SignalP 4.1 Server, TMHMM 2.0 Server, ProtScale，ProtParam在線工具對 Dock7 氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測與分析。

表1 不同物種的Dock7 基因序列來源Table 1 The source of sequences for Dock7 gene in different species

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物種Dock7基因核苷酸分析

2.1.1 多態(tài)位點(diǎn)、單倍型及核苷酸多樣性分析 所研究的27個物種中，人包含6條序列，虎鯨7條，白犀牛4條，雪貂6條，佛羅里達(dá)海牛7條，星鼻鼴鼠5條，裸鼢鼠3條，非洲跳鼠3條，八齒鼠2條，原雞2條，爪蟾7條，其他各為一條，共68條序列。

所分析片段長度為4 551 bp，發(fā)現(xiàn)1855個多態(tài)位點(diǎn)，百分率為40.76% ，其中單一多態(tài)位點(diǎn)163個，百分率為3.58%，簡約多態(tài)位點(diǎn)1692 個, 百分率為37.18%，27個物種平均核苷酸差異數(shù)(k)為472.076，核苷酸多樣性為0.10373。27個物種中共發(fā)現(xiàn)28種單倍型，單倍型的多樣性為0.949，說明Dock7基因種間變異程度較大。Dock7基因在種內(nèi)變異很小，只在原雞中發(fā)現(xiàn)一個多態(tài)位點(diǎn)。

2.1.2 核苷酸歧異度、遺傳分化和凈遺傳距離 27個物種Dock7基因遺傳分化(Gst)在0.333～1.000之間(表2)，核苷酸歧異度(Dxy)和凈遺傳距離(Da)都在0.042～0.223之間。不同物種間核苷酸歧異度和凈遺傳距離的變化范圍均很大，原雞、爪蟾與其他26個物種間遺傳分化明顯?；ⅥL和白犀牛、雪貂、人的核苷酸歧異度、凈遺傳距離最小，爪蟾與其它物種間的核苷酸歧異度、凈遺傳距離最大，根據(jù)不同物種間的核苷酸歧異度(Dxy)，用MEGA4.0軟件的UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建不同物種分子聚類圖(圖1)，由聚類圖與表中數(shù)據(jù)(表2)說明，虎鯨和白犀牛、雪貂、人之間Dock7基因遺傳分化較小，爪蟾與本研究中其他物種間遺傳分化較大。

2.2 不同物種Dock7 基因氨基酸分析

2.2.1 密碼子偏愛性 有效密碼子數(shù)(Effective Number of Codon, ENC)是一個基因密碼子的使用頻率與同義密碼子的平均使用頻率偏差的量化值,其范圍在20(每個氨基酸只使用一個密碼子的極端情況)到61(各個密碼子均被平均使用)之間, 該數(shù)值越靠近20表明偏好性越強(qiáng),表達(dá)水平也越高,越靠近61表示偏好性越弱,表達(dá)程度越低[4]。密碼子偏好性指數(shù)CBI 值反映了基因中高表達(dá)偏好密碼子的組成情況, 也能反映偏好性和表達(dá)水平的程度[5]。Bennetzen等[6]和Comeron等[7]報道,密碼子偏愛指數(shù)的值在0～1間變動, 如果密碼子偏愛指數(shù)的值為0 ,則說明同義密碼子被均勻使用, 這個值越大, 則說明密碼子使用偏愛情況越嚴(yán)重。所選不同物種Dock7 基因序列編碼區(qū)中密碼子有效值(ENC)為50.496,靠近各個密碼子均被平均使用的最大值61,偏愛指標(biāo)(CBI)為0.220，表明Dock7基因密碼子偏愛性較均一, 各密碼子在編碼氨基酸時出現(xiàn)的頻率較一致。

圖1 根據(jù)物種間的核苷酸歧異度構(gòu)建的聚類圖Fig.1 Phylogenetic tree based on genetic differentiation of species

表2 不同物種核苷酸歧異度和遺傳分化Table 2 Nucleotides diversity and genetic differentiation in different species

注：上三角為遺傳分化(Gst)；下三角為核苷酸歧異度(Dxy)和凈遺傳距離(Da) (括號內(nèi))。

Note: Upper triangular is genetic differentiation(Gst); Lower triangular is nucleotide divergence(Dxy)and net genetic distance(Da) (in brackets).

2.2.2 同義替換和非同義替換 27個物種68條Dock7基因序列編碼區(qū)中同義替換平均位點(diǎn)數(shù)為963.73個，非同義替換平均位點(diǎn)數(shù)為3584.27個。不同物種同義替換位點(diǎn)數(shù)(SS)為945.17～1013.83 (表3)，同義替換核苷酸多樣性均值(π(s))為0.02612；非同義替換位點(diǎn)數(shù)(NSS)為3534.17～3602.83，非同義替換核苷酸多樣性均值(π(a))為0.12473。本研究中發(fā)現(xiàn)，27個物種Dock7基因的非同義替換位點(diǎn)數(shù)均明顯高于同義替換位點(diǎn)數(shù)，佛羅里達(dá)海牛的非同義替換位點(diǎn)數(shù)較其它物種多，其次是星鼻鼴鼠、虎鯨，說明佛羅里達(dá)海牛Dock7基因編碼區(qū)的非同義替換較其它物種高，星鼻鼴鼠、虎鯨分別為第二、第三。由于達(dá)爾文的正向選擇有些基因中非同義替代速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同義替代[8]，因此推測本研究27個物種Dock7基因在進(jìn)化過程中可能受到了正向選擇的影響。

表3 不同物種Dock7基因同義替換和非同義替換Table 3 Synonymous and nonsynonymous substitution of Dock7 gene in different species

2.2.3 氨基酸序列的組成成分及理化性質(zhì)分析 用ProtParam在線工具分析27個物種Dock7基因編碼的氨基酸序列，對蛋白質(zhì)的各種理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，大約含有2100個氨基酸殘基，分子量約為238 kD，理論等電點(diǎn)均低于7.00，說明該蛋白呈酸性，27個物種Dock7蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)在49.73～54.17之間，表明這種蛋白質(zhì)不穩(wěn)定[9]，脂肪系數(shù)在84.23～87.32之間，疏水性評估系數(shù)在-0.383 ～-0.305之間，在所有分析的物種中相對含量較多的氨基酸為Leu，含量在10.7%～11.3%之間；其次是Ser，含量在8.8%～10.0%之間；再次是Glu，含量在6.8%～7.3%之間，其中27個物種總氨基酸中負(fù)電荷殘基總數(shù)約為262和正電荷殘基總數(shù)約為244。

2.2.4 信號肽的預(yù)測與分析 一般認(rèn)為,每一個需要運(yùn)輸?shù)亩嚯亩己幸欢伟被嵝蛄?稱為信號肽序列(signal peptide,SP),引導(dǎo)多肽至不同的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[10]。信號肽幫助蛋白質(zhì)穿膜，與蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位有關(guān)，通過分析蛋白序列N端信號肽的有無,可以初步判斷某個蛋白是否為分泌蛋白[11,16]。利用蛋白分析專家EXPASY工具里的SignalP 4.1 Server[12]對27個物種Dock7氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果只在原雞Dock7氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)一段信號肽信號，位于原雞氨基酸序列第1～23位氨基酸位置，其存在的可能性為0.475，在第23和24位氨基酸之間存在一個信號肽切割位點(diǎn)(圖2)，剪切位點(diǎn)(C-score)最高在第24個氨基酸位置，分值為0.206，綜合剪切點(diǎn)分值(Y-score)在第24個氨基酸處最大，分值為0.344，信號肽分值(S-score)最大在第1個氨基酸位置，為0.808，第1～23個氨基酸的平均S-score為0.585，其他26個物種的Dock7基因的氨基酸序列均無信號肽。

家雞是人類馴化較早的家禽，人類重要的食物來源，與人類文化生活密切相關(guān)，原雞與家雞有一定的親緣關(guān)系，有學(xué)者認(rèn)為家雞極有可能起源于紅色原雞中的部分亞種[13]，王文等人[14]和Liu等人[15]對原雞和家雞線粒體DNA部分序列進(jìn)行多態(tài)分析, 認(rèn)為家雞可能起源于不同的原雞亞群體，原雞的Dock7基因的氨基酸序列有信號肽，因此通過對家雞的氨基酸是否具有信號肽及信號肽的具體功能的進(jìn)一步研究，為家雞的遺傳育種和開發(fā)利用提供參考。

圖2 原雞Dock7蛋白信號肽分析Fig.2 Signal peptide analysis of Dock7 protein in Gallus

2.2.5 跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析 跨膜結(jié)構(gòu)域常常是由跨膜蛋白的效應(yīng)區(qū)域所展現(xiàn)，一般由20個左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α-螺旋[16]。分泌蛋白和膜蛋白都含有信號肽序列, 所不同的是分泌蛋白在信號肽之外不再有疏水的跨膜區(qū)，而膜蛋白在信號肽之外還有一個以上的疏水跨膜區(qū)[17]。利用在線工具TMHMM 2.0 Server[18]對27個物種Dock7 氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示本研究中27個物種的 Dock7 氨基酸序列均不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，整條肽鏈位于細(xì)胞外，結(jié)合信號肽的預(yù)測，說明原雞的Dock7蛋白屬于分泌蛋白，其他26個物種的Dock7蛋白不屬于膜蛋白或分泌蛋白，可以推測出，原雞的Dock7蛋白可能存在轉(zhuǎn)運(yùn)，其他26個物種的Dock7基因在游離核糖體上起始合成后可能不存在轉(zhuǎn)運(yùn)，而是繼續(xù)留在細(xì)胞質(zhì)中行使功能。

2.2.6 疏水性/親水性的預(yù)測和分析 疏水性和親水性分析對于預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和功能域具有重要的生物學(xué)意義。疏水性的氨基酸傾向于遠(yuǎn)離周圍水分子，親水氨基酸通常處于蛋白質(zhì)分子的表面[19]。利用在線工具 ProtScale[20]對27個物種Dock7 氨基酸序列的疏水性/親水性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示本研究27個物種的Dock7氨基酸序列最低分值為-4.500，親水性最強(qiáng)；最高分值為4.500，疏水性最強(qiáng)。總體上看，親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，故整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，因此認(rèn)為Dock7蛋白是親水性蛋白，處于蛋白質(zhì)分子的表面。

2.2.7 二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈本身的折疊方式，蛋白質(zhì)分子的多肽鏈一般是部分卷曲盤旋成螺旋狀(α-螺旋結(jié)構(gòu))，或折疊成片層狀(β-折疊結(jié)構(gòu))，或以不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)存在于生物體內(nèi)[21]。用 PBIL LYON-GERLAND 信息庫對27個物種Dock7 氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示本研究中27個物種的Dock7 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件是自由卷曲(42.16%～46.50%)，其次是α-螺旋(41.35%～45.37%)、伸展片段(11.26%～13.17%)。

3 小 結(jié)

對27個物種Dock7基因核苷酸分析，說明Dock7基因種間變異程度較大，種內(nèi)變異很小，只在原雞中發(fā)現(xiàn)一個多態(tài)位點(diǎn)；對27個物種Dock7基因氨基酸分析，結(jié)果只在原雞Dock7基因的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)一段信號肽信號，其他26個物種的Dock7基因的氨基酸序列無信號肽。27個物種均無跨膜結(jié)構(gòu)域，整條肽鏈位于細(xì)胞外，說明原雞的Dock7蛋白屬于分泌蛋白，其他26個物種的Dock7蛋白不屬于膜蛋白或分泌蛋白。

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