秦靈靈，徐暾海，桂海水，劉銅華△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

胰島素抵抗不但是2型糖尿病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)，同時(shí)又是多種代謝疾病發(fā)病的始發(fā)因素。近年來(lái)，以2型糖尿病、代謝綜合癥為代表的代謝性疾病發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)，因此針對(duì)胰島素抵抗的相關(guān)研究業(yè)已成為人們最為關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。臨床報(bào)道匙羹藤在對(duì)糖尿病的防治方面有明確的療效，但是在實(shí)驗(yàn)研究方面多停滯在藥效的驗(yàn)證層面，缺乏對(duì)其作用機(jī)制的深入研究。本研究從胰島素抵抗為切入點(diǎn)，從分子水平探討匙羹藤改善KKAy小鼠脂肪組織胰島素抵抗的可能機(jī)制，借以豐富匙羹藤抗糖尿病作用的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性6～7周齡，雄性KKAY小鼠18只，體質(zhì)量26g±3g;同周齡雄性C57BL/6J小鼠9只，體質(zhì)量22g±3g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所(許可證號(hào)SCXK京2009-0004)。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物室內(nèi)設(shè)置12 h晝夜循環(huán)，并維持室溫23℃ ±2℃，濕度55±10%。動(dòng)物采用單籠喂養(yǎng)，期間自由攝食、飲水，KK鼠料購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所。

1.2 藥物與試劑

匙羹藤提取物由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供:匙羹藤生藥飲片5kg，加水煎煮3次，料液比分別為 1∶10、1∶10、1∶8，煎煮時(shí)間分別為:1.5、1.5、1h，分別過(guò)濾合并濾液，濾液減壓濃縮至稠膏，70℃真空干燥，粉碎，過(guò) 80目篩，得匙羹藤提取物0.33kg;小鼠放免試劑盒(Merck millipore公司);血糖試紙(日本愛(ài)科來(lái)試劑公司);Trizol試劑盒(Invitrogen公司);PCR引物(生工生物工程上海有限公司);Real-time PCR擴(kuò)增試劑盒(中原領(lǐng)先科技有限公司)

1.3 儀器

4℃低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);Real-Time PCR儀(美國(guó) ABI 7500);核酸紫外分光光度計(jì)(德國(guó)Biophotometer公司);血糖儀(日本愛(ài)科來(lái)公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 KKAy雄性小鼠18只斷尾取血，測(cè)隨機(jī)血糖值≥13.9mmol/L者入選，18只全部入選。按照血糖隨機(jī)分為模型組(DM)9只，匙羹藤提取物組(GS)9只，另取 9只雄性C57BL/6J小鼠作為空白對(duì)照組(NC)。每日GS組小鼠按照2.5g/kg灌胃給藥共8周，DM組、NC組小鼠灌胃等體積無(wú)菌水。

1.4.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 (1)一般情況觀察:觀察小鼠毛色、神態(tài)、精神狀態(tài)、活動(dòng)度等情況，隨時(shí)記錄;(2)體質(zhì)量:在給藥周期內(nèi)，各組小鼠于每周末禁食不禁水，8h后測(cè)量體質(zhì)量;(3)空腹血糖、空腹血清胰島素:在給藥周期內(nèi)，各組小鼠于每周末禁食不禁水，8h后剪尾采用血糖試紙測(cè)定血糖(7∶00～15∶00禁食);末次給藥后小鼠禁食不禁水(00∶00～08∶00)，8h 后剪尾用試紙法測(cè)定空腹血糖;摘眼球取血后靜置3h，3500r/min分離血清，采用放射免疫法測(cè)定空腹血清胰島素水平;(4)胰島素敏感指數(shù)(ISI)檢測(cè):采用李光偉法，ISI=1/(FPG×Fins)，取自然對(duì)數(shù)正態(tài)化后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;(5)實(shí)時(shí) 熒 光 PCR 法 檢 測(cè) PPAR-γmRNA、PI3κ-p85 mRNA、CAPmRNA、GluT-4mRNA:處死各組小鼠，速取部分附睪脂肪墊，置入液氮中以備檢測(cè)用。①總RNA提取:從液氮中取出脂肪組織放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮進(jìn)行快速研磨，采用Trizol一步法提取總RNA，采用核酸紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所獲RNA濃度與純度;②引物序列:PPAR γ上游引物:5’-GCCCTTTGGTGACTTTATGG-3’，下 游 引 物:5’-CTTCACGTTCAGCAAGCCT-3’，139bp;PI3κ-p85 上游引物:5’-GGGAGACATCTCAAGGGAAG-3’，下游引物:5’-TTTCCATCACGGTGAAAGATT-3’，162bp;CAP上游引物:5’-TCTTTCAGATCCTGCCTCAG-3’，下游引物:5’-TAGCATCCTTTGCCCTTCTC-3’，110bp;GluT4 上 游引 物:5’-ACTCATTCTTGG ACGGTTCC-3’，下 游 引 物:5’-TAGCTGTGCC CAGCATAGAC-3’，188bp;參照基因 GAPDH;上游引物:5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，下游引物:5’-CAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’，154bp;③RNA的體外反轉(zhuǎn)與Real-Time PCR:經(jīng)25μL反轉(zhuǎn)錄體系，42℃孵育60min，然后70℃10min，將所得的cDNA與下列物質(zhì)加入20μL Real-Time PCR體系，94℃預(yù)變性 1min，94℃ 15s，60℃ 34s，72℃ 15s 40個(gè)循環(huán)，72℃ 10min，用相對(duì)定量 2－△△CT法分析結(jié)果;(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，全部數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)

模型組小鼠在給藥過(guò)程中死亡1只，可能由于灌胃操作失敗導(dǎo)致藥液進(jìn)入肺臟造成肺炎所致。在給藥期內(nèi)，NC組對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)自如，皮毛有光澤;DM小鼠精神萎靡，行為倦怠，反應(yīng)遲鈍，動(dòng)作遲緩，皮毛干枯無(wú)光澤，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，這些情況逐漸加重;GS組與DM組小鼠狀態(tài)類(lèi)似，但是程度較輕，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)。

2.2 匙羹藤提取物對(duì)KKAy小鼠體質(zhì)量影響

表1顯示，在給藥過(guò)程中，DM組小鼠體質(zhì)量明顯高于NC組(P＜0.01)，與DM組比較，GS組體質(zhì)量在第5周時(shí)出現(xiàn)降低(P＜0.05)，從第6周開(kāi)始出現(xiàn)明顯降低(P＜0.01)并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

表1 各組KKAy小鼠體質(zhì)量水平(±s)

表1 各組KKAy小鼠體質(zhì)量水平(±s)

注:與NC比較:⊙P ＜0.01，與DM比較:#P ＜0.05，*P ＜0.01

組別 數(shù)量 2周 4周 5周 6周 8周2.24 28.10±2.67 DM 8 36.73±0.95⊙ 40.21±1.64⊙ 41.61±2.08⊙ 41.20±2.89⊙ 39.64±1.84⊙GS 9 35.99±1.62 38.80±1.73 38.39±1.54# 37.93±1.60* 36.22±1.59 NC 9 26.12±1.01 27.88±1.60 28.39±1.71 29.01±*

2.3 匙羹藤提取物對(duì)KKAy小鼠 FPG、Fins、ISI的影響

在給藥過(guò)程中，DM組小鼠FPG明顯高于NC組(P＜0.01)，與DM組比較，GS組FPG在第6周時(shí)出現(xiàn)降低(P＜0.05)，從第7周開(kāi)始出現(xiàn)明顯降低(P＜0.01)并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

表2顯示，給藥8周后，與NC組比較，DM組Fins水平明顯升高(P＜0.01)，ISI明顯降低(P＜0.01)，與 DM組比較，GS組 Fins水平降低(P＜0.05)，ISI升高(P ＜0.01)。

2.4 匙羹藤提取物對(duì)KKAy小鼠 脂肪組織PPAR-γmRNA 的影響

圖1顯示，藥物干預(yù)8周后，DM組脂肪組織PPAR-γmRNA表達(dá)較NC組明顯降低(0.47±0.14 vs 1.03±0.29，P＜0.01)，GS組較 DM 組明顯升高(0.92±0.14 vs 0.47±0.14，P ＜0.01)。

表2 各組 KKAy小鼠 FPG、Fins、ISI水平(±s)

表2 各組 KKAy小鼠 FPG、Fins、ISI水平(±s)

注:與NC比較:⊙P ＜0.01，與DM比較:#P ＜0.05，*P ＜0.01

組別 數(shù)量 FPG(mmol/L)0.83±0.22 －1.61±0.27 DM 8 27.51±1.74⊙ 30.74±1.13⊙ 32.14±1.05⊙ 31.69±1.27⊙ 1.97±0.31⊙ －4.12±0.16⊙GS 9 27.24±2.03 29.59±1.46 30.94±1.32# 28.91±1.55* 1.52±0.47# －3.74±0.30 ISI NC 9 5.97±0.97 6.30±0.83 6.26±0.76 6.28±0.70 2周 4周 6周 8周Fins(ng/mL)8周*

圖1 各組 KKAy小鼠脂肪組織 PPAR-γmRNA的表達(dá)量(±s)

2.5 匙羹藤提取物對(duì)KKAy小鼠 脂肪組織PI3κ-p85 mRNA 的影響

圖2顯示，藥物干預(yù)8周后，DM組脂肪組織PI3κ-p85mRNA表達(dá)較NC組明顯降低(0.48±0.10 vs 1.08±0.27，P ＜0.01)，GS組較 DM 組明顯升高(0.68±0.07 vs 0.48±0.10，P ＜0.01)。

圖2 各組 KKAy小鼠脂肪組織 PI3κ-p85mRNA的表達(dá)量(±s)

2.6 匙羹藤提取物對(duì)KKAy小鼠 脂肪組織CAPmRNA的影響

圖3顯示，藥物干預(yù)8周后，DM組脂肪組織CAPmRNA表達(dá)較NC組明顯降低(0.37±0.10 vs 1.02±0.27，P＜0.01)，GS組較 DM 組明顯升高(0.79±0.20 vs 0.37±0.10，P ＜0.01)。

圖3 各組 KKAy小鼠脂肪組織 CAPmRNA的表達(dá)量(±s)

2.7 匙羹藤提取物對(duì)KKAy小鼠 脂肪組織GluT-4mRNA的影響

圖4顯示，藥物干預(yù)8周后，DM組脂肪組織GluT-4mRNA表達(dá)較NC組明顯降低(0.26±0.07 vs 1.05±0.33，P ＜0.01)，GS組較 DM 組明顯升高(0.63±0.09 vs 0.26±0.07，P ＜0.01)。

3 討論

圖4 各組KKAy小鼠脂肪組織GluT-4mRNA的表達(dá)量(±s)

匙羹藤主要分布于我國(guó)兩廣地區(qū)，是民間使用及臨床報(bào)道具有治療糖尿病作用的單味中藥。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，其具有一定的降糖［1，2］以及降脂作用［3］。當(dāng)前的研究結(jié)果顯示，通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌及合成，借以改善糖耐量是匙羹藤降糖作用的主要機(jī)制。胰島素抵抗是在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中占有首要位置的病理因素，關(guān)于匙羹藤對(duì)于胰島素抵抗方面的研究卻很少，故本實(shí)驗(yàn)以胰島素抵抗為研究切入點(diǎn)對(duì)其抗糖尿病的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

脂肪組織是胰島素作用的外周靶組織，也是糖脂代謝進(jìn)行以及交叉作用的主要場(chǎng)所，其中分布于脂肪細(xì)胞中對(duì)糖代謝和脂肪細(xì)胞分化均具有重要調(diào)節(jié)作用的PPAR-γ是當(dāng)前研究IR的集中關(guān)注點(diǎn)，同時(shí)也是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類(lèi)藥物作用的靶點(diǎn)。PPAR-γ具有高位調(diào)控作用，其可通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)IR具有改善作用，其中通過(guò)增加胰島素介導(dǎo)GluT-4轉(zhuǎn)運(yùn)的受體后PI3κ以及Cb1-CAP信號(hào)通路中關(guān)鍵因子PI3κ-p85、CAP的轉(zhuǎn)錄水平，增加GluT-4基因表達(dá)量和葡萄糖的攝取率，改善胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而緩解IR是其最重要也是最直接的調(diào)控作用之一［4～7］。本實(shí)驗(yàn)以 PPARγ為研究初始點(diǎn)，以GluT-4表達(dá)量為有效性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及作用的終點(diǎn)事件，觀察脂肪組織中胰島素介導(dǎo)GluT-4轉(zhuǎn)運(yùn)受體后信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的變化，借以追蹤干預(yù)藥物作用機(jī)制的靶點(diǎn)路徑。

采用與人類(lèi)2型糖尿病病理基礎(chǔ)相似的動(dòng)物模型是進(jìn)行研究的首要環(huán)節(jié)。KKAy小鼠是一種自發(fā)的2型糖尿病小鼠，具有肥胖、高血糖、血脂異常、高胰島素血癥等特征。該小鼠從8周起就開(kāi)始出現(xiàn)IR，而具有IR特征的小鼠存在PI3κ信號(hào)通路傳導(dǎo)障礙和GLUT4mRNA表達(dá)量減少等特征［8］，與本實(shí)驗(yàn)的研究思路相吻合，故選用此動(dòng)物模型作為觀察對(duì)象。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，匙羹藤能夠改善KKAy小鼠空腹血糖水平、空腹血清胰島素以及胰島素敏感指數(shù)，并推論其緩解胰島素抵抗與其增加脂肪組織PPARγmRNA，進(jìn)而增加被其調(diào)控的 PI3κ-p85、CAP基因轉(zhuǎn)錄水平，從而上調(diào)GluT-4mRNA水平、促進(jìn)葡萄糖的攝取相關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)并未觀察PI3κ-GluT4以及Cb1-CAP-GluT4這兩條信號(hào)通路中下游相關(guān)關(guān)鍵因子的變化，無(wú)法判斷最后影響葡萄轉(zhuǎn)運(yùn)的是兩條通路抑或是其中的一條，故應(yīng)對(duì)其各自下游的磷酸肌醇依賴(lài)的蛋白激酶(PDK-1)、蛋白激酶B(PKB)以及磷酸化的PKB、AS160以及磷酸化的AS160、CrkⅡ蛋白、C3G蛋白、TC10等因子進(jìn)行更深一步的研究。另外本實(shí)驗(yàn)對(duì)于分布于脂肪細(xì)胞膜表面的GluT4蛋白表達(dá)量未做觀察，在以后的研究中將會(huì)應(yīng)用蛋白免疫印跡法對(duì)分布于細(xì)胞膜的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白做定量評(píng)判，以便為評(píng)估葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率提供更為客觀、直接的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

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