富 蘇，韓經(jīng)丹，周 杰，范吉平△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700;2.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700;3.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102)

近幾年，在各種腦缺血模型中均可看到神經(jīng)元壞死伴有凋亡發(fā)生，并認(rèn)為凋亡是缺血性神經(jīng)元死亡的一種形式。細(xì)胞凋亡成為腦缺血損傷中的研究熱點(diǎn)，并成為開發(fā)治療藥物的治療靶點(diǎn)。熊膽粉味苦性寒，歸肝、膽、心、胃經(jīng)，功用清熱解毒。導(dǎo)師范吉平教授依據(jù)多年中風(fēng)病治療的臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熊膽粉對腦缺血損傷具有良好的保護(hù)作用。我們課題組之前的研究也已證實(shí)，熊膽粉可促進(jìn)腦缺血損傷大鼠神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)，減輕神經(jīng)元病理損害，減少細(xì)胞凋亡水平。本研究將試圖在上述研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示熊膽粉減少腦缺血損傷大鼠缺血半暗帶皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性健康成年大鼠，體質(zhì)量320～350g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)SCXK(京)2006-0009)。

1.2 藥物

熊膽粉由山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司提供。陽性對照藥物尼莫地平(商品名尼膜同)購于拜耳醫(yī)藥(國藥準(zhǔn)字H20003010，生產(chǎn)批號(hào)BJ03850)。

1.3 主要儀器和試劑

恒溫手術(shù)臺(tái)(SHOR-LINE);MCAO線栓(沙東線栓);電子分析天平(Sartorius);Narrow-Alley Corner Test實(shí)驗(yàn)儀器(北京寬街醫(yī)院);石蠟包埋機(jī)(Leica，EG1150H);石蠟切片機(jī)(Leica，RM2255);正置顯微鏡(Olympus BX51);光學(xué)照像生物顯微鏡(Leica，DMLB-HC);圖像采集系統(tǒng)(Leica DM4000B);圖像分析系統(tǒng)(Image-pro Plus 5.0)。

水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);0.9%生理鹽水(石家莊四藥);4%多聚甲醛(SUNBIO);超純水(中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心機(jī)能實(shí)驗(yàn)室);乙醇、二甲苯、鹽酸酒精、兔抗大鼠Bax、Bcl-2、CytC、Caspase-9、Caspase-3 免疫組化試劑盒(武漢博士德)。

1.4 造模方法

大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 mL·100 g－1)，大鼠麻醉成功后仰臥位固定，頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈搭一根尼龍線系活扣，頸外動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端分別用一根尼龍線結(jié)扎，2根結(jié)扎尼龍線之間間距0.5 cm。頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾夾閉后，在頸外動(dòng)脈上兩根結(jié)扎的尼龍線之間剪短，后將頸外動(dòng)脈近心端下翻，與境內(nèi)動(dòng)脈成一天直線，從頸外動(dòng)脈剪一個(gè)小口插入線栓，插入長度約為(20.0±0.5)mm時(shí)感到有輕微阻力時(shí)停止，在頸內(nèi)動(dòng)脈處扎緊尼龍線并固定線栓，扎緊頸總動(dòng)脈近心端尼龍線，取下動(dòng)脈夾，縫合皮膚。術(shù)后常規(guī)護(hù)理。待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清醒后進(jìn)行Zea-Longa神經(jīng)功能評分，神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)為:①無神經(jīng)功能損傷癥狀，動(dòng)物正常活動(dòng)，進(jìn)食評0分;②將動(dòng)物尾巴提起后，左前肢屈曲1分;③將動(dòng)物放置平板上向左側(cè)轉(zhuǎn)圈2分;④將動(dòng)物放置平板上，用手輕推向左側(cè)傾倒3分;⑤動(dòng)物左側(cè)偏癱，不能自發(fā)行走意識(shí)朦朧或喪失4分。評分大于或等于2分，則表明模型成功，低于2分則予以去除。

1.5 分組與給藥

造模成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，根據(jù)神經(jīng)功能評分分層隨機(jī)分為五組，分別為正常對照組(蒸餾水)、假手術(shù)組(蒸餾水)、模型組(蒸餾水)、尼莫地平組(尼莫地平研碎蒸餾水溶解，按照臨床用量人大鼠體表面折算給藥劑量為 32.4 mg·kg－1，配制成藥物濃度為3.24 mg·mL－1的蒸餾水溶液)、熊膽粉組(通絡(luò)化痰膠囊蒸餾水溶解，按照臨床用量人大鼠體表面折算給藥劑量為27 mg·kg－1，配制成藥物濃度為2.7 mg·mL－1的蒸餾水溶液)。從術(shù)后第1天開始給藥，以1 mL·100 g－1體質(zhì)量體積灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃給藥7d。

1.6 取材及標(biāo)本制作

術(shù)后第8天每組隨機(jī)取6只，10%水合氯醛深度麻醉(0.35 mL·100 g－1)，迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，于心尖部剪開左心室，插管至主動(dòng)脈，快速注入100 ml生理鹽水沖洗后，再以體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛(PH值調(diào)成7.0左右)灌注固定后斷頭取腦。取得的腦組織入4℃4%多聚甲醛固定液中固定過夜，經(jīng)過固定、脫水、透明、石蠟包埋處理，連續(xù)冠狀切片，切片厚度為5 μm。

1.7 免疫組織化學(xué)測 Bax、Bcl-2、CytC、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)的變化

組織切片，常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)后用0.3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，37℃孵育5 min三遍，滴加一抗;37℃孵育2 h，滴加二抗;37℃孵育30 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液;37℃孵育50 min，DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。首先在40倍光鏡下定位缺血側(cè)缺血半暗帶額頂葉皮層，每組6只，每只動(dòng)物取5張相同部位腦片，后在400倍光鏡下選取5個(gè)相鄰視野對陽性神經(jīng)元(胞漿呈棕黃色顆粒)進(jìn)行觀察，采用Image-pro Plus 5.0軟件測定陽性細(xì)胞的光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 熊膽粉對pMCAO大鼠缺血半暗帶皮層細(xì)胞CytC、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)的影響

表1圖1～圖3顯示，正常對照組和假手術(shù)組CytC、Caspase-9和Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)不明顯，模型組可見CytC、Caspase-9和Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)增多，與正常對照組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿呈棕黃色，甚至胞核濃染呈棕褐色，有顆粒或塊狀沉淀。與模型組比較，熊膽粉及尼莫地平給藥干預(yù)后其 CytC、Caspase-9和Caspase-3陽性表達(dá)減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，P ＜0.05)。

Table 1 Effect of Bear bile power on the expression of CytC，Caspase-9 and Caspase-3 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(－x ± s)

Fig 1 Effect of Bear Bile Power on the expression of CytC of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

2.2 熊膽粉對pMCAO大鼠缺血半暗帶皮層Bax、Bcl-2免疫組化結(jié)果的影響

Fig 2 Effect of Bear Bile Power on the expression of Caspase-9 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

Fig 3 Effect of Bear Bile Power on the expression of Caspase-3 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

表2圖4、5顯示，正常對照組和假手術(shù)組可見Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿濃染呈棕褐色，有顆?；驂K狀沉淀;熊膽粉組及尼莫地平給藥干預(yù)后可見的Bcl-2陽性表達(dá)增多，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。正常對照組和假手術(shù)組Bax陽性細(xì)胞表達(dá)不明顯，模型組可見Bax陽性細(xì)胞表達(dá)增多，表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿呈棕黃色，甚至胞核濃染呈棕褐色，成團(tuán)塊狀;與模型組比較，熊膽粉組及尼莫地平給藥干預(yù)后其Bax蛋白減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。

Table 2 Effect of Bear bile power on the expression of Bax and Bcl-2 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(±s)

Table 2 Effect of Bear bile power on the expression of Bax and Bcl-2 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(±s)

注:＊＊ P ＜0.01 vs Model Group;*P ＜0.05 vs Model Group;##P ＜0.01 vs Sham Group;#P ＜0.05 vs Sham Group

Group n Bax(IOD)Bcl-2(IOD)Normal 6 56.91 ±6.03 45.67 ±8.04 Sham 6 54.87 ±5.68 47.33 ±7.67 Model 6 98.70 ±7.83## 71.44 ±5.45##Nimodipine 6 66.93 ±6.74＊＊ 97.52 ±6.05＊＊BBP 6 72.57 ±5.74＊＊ 86.38 ±6.72＊＊

Fig 4 Effect of Bear Bile Power on the expression of Bax of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

3 討論

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡(programed cell death，PCD)，是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。MacManuS等在1993年首次報(bào)道大鼠全腦缺血與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，至此之后神經(jīng)細(xì)胞凋亡在腦缺血損傷中的作用日益受到關(guān)注。研究表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血損傷病理作用的重要環(huán)節(jié)，是造成腦缺血損傷后繼發(fā)性損害的重要機(jī)制［1，2］。腦缺血損傷既可造成細(xì)胞壞死，又可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞壞死是一個(gè)不可逆的過程，而細(xì)胞凋亡則是受一系列程序調(diào)控的過程，在腦缺血損傷后及早進(jìn)行抗凋亡治療具有重要意義［3］。

Fig 5 Effect of Bear Bile Power on the expression of B Bcl-2of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

細(xì)胞凋亡中最經(jīng)典的途徑之一為線粒體途徑(內(nèi)途徑)。線粒體對于多細(xì)胞生物至關(guān)重要。沒有線粒體細(xì)胞會(huì)停止有氧呼吸并迅速死亡，這一機(jī)制也是很多凋亡通路的關(guān)鍵。凋亡蛋白通過不同的方式以線粒體為靶點(diǎn)破壞線粒體的作用，通過線粒體膜孔道的形成導(dǎo)致線粒體腫脹，或者通過提高線粒體膜的通透性導(dǎo)致凋亡效應(yīng)器的漏出［4］。線粒體直接或間接地形成特定的孔道來釋放凋亡因子，如細(xì)胞色素C。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞色素C與Apaf-1聚合，吸引caspase-9前體形成凋亡(apoptosome)。這導(dǎo)致caspase-9的分裂和激活，caspase-9同時(shí)可以反過來分裂和激活下游的caspase-3，后者起到細(xì)胞凋亡過程效應(yīng)器的作用。研究表明［5～7］，在caspase家族中，caspase-3是caspase級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，它在正常細(xì)胞中是以酶原形式存在，受凋亡刺激因素作用后激活，活化的caspase-3可以激活核因子、細(xì)胞骨架蛋白及DNA修復(fù)酶等，引起細(xì)胞形態(tài)的變化，如出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、DNA裂解、染色體濃縮和凋亡小體的形成等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，caspase-3在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用。通過抑制caspase-3的活化，可以產(chǎn)生對缺血性腦損傷的保護(hù)作用［8～10］。Bcl-2家族基因是腦缺血神經(jīng)元凋亡調(diào)控基因的重要組成部分。Bcl-2蛋白家族包括Bcl-2樣促生存亞家族(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等)和Bcl-2樣促凋亡亞家族(Bax、Bak、Bcl-xS等)2種。目前研究較多的是Bax和Bcl-2蛋白，Bcl-2增高，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡;Bax增高，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［11］，研究已發(fā)現(xiàn)Bax和Bcl-2將直接進(jìn)入到細(xì)胞凋亡的線粒體途徑(內(nèi)途徑)中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程。

熊膽粉味苦性寒，歸肝、膽、心、胃經(jīng)，功用清熱解毒，課題組既往臨床試驗(yàn)也證實(shí)，以熊膽粉為君藥的通絡(luò)化痰膠囊可減少腦梗死病人的神經(jīng)功能缺損癥狀［12］。腦缺血損傷后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)所形成的一系列神經(jīng)生化毒素，導(dǎo)致神經(jīng)功能損害，當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)痰、瘀、毒邪范疇，亦為應(yīng)用中藥抑制或阻斷缺血后級(jí)聯(lián)反應(yīng)成為中醫(yī)藥治療中風(fēng)病的特色機(jī)制。本研究揭示腦缺血損傷后早期應(yīng)用熊膽粉可以調(diào)節(jié)腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡線粒體途徑中關(guān)鍵蛋白CytC、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，并且可調(diào)節(jié)參與調(diào)節(jié)腦缺血損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡線粒體途徑中的Bcl-2基因家族成員Bcl-2和Bax，這可能是熊膽粉促進(jìn)腦缺血損傷大鼠損傷后神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)、減輕神經(jīng)元病理損害、減少細(xì)胞凋亡水平的分子機(jī)制之一。

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