封瑞，胡慧媛，郭鳳，于麗鳳，趙美瞇，龜山正樹，郝麗英

（1.中國醫(yī)科大學藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110001；2.鹿兒島大學醫(yī)學部，鹿兒島 890?8544，日本）

L型鈣通道是一類電壓依賴性鈣通道，是細胞興奮時外鈣內(nèi)流的主要途徑。其在許多生理和病理情況下起到重要的作用，例如在基因表達、肌肉收縮、激素分泌等方面都具有關(guān)鍵作用［1］。研究顯示，心腦血管疾病與心臟和大腦的L型鈣通道功能紊亂密切相關(guān)［2～4］。近些年，關(guān)于L型鈣通道的研究已深入到分子水平。研究表明［5～7］，L型鈣通道的C末端是細胞因子對其功能調(diào)節(jié)的主要區(qū)域。為了對L型鈣通道C末端的不同部位進行系統(tǒng)研究，通常需要獲得L型鈣通道蛋白的不同片段以進行體外實驗。我們前期研究［8～10］發(fā)現(xiàn)，L型鈣通道C末端的CT1（1509?1789）片段是鈣離子、鈣調(diào)蛋白（calmodu?lin，CaM）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）等細胞因子的結(jié)合部位和調(diào)節(jié)部位，因此獲得該片段的蛋白具有重要意義。

研究表明，CaM可與心肌細胞Cav1.2鈣通道CT1片段結(jié)合從而對鈣通道鈣離子依賴性易化作用進行調(diào)節(jié)［5］；CaMKⅡ也可磷酸化CT1片段上的1 512、1 570和1 695位點以調(diào)節(jié)鈣通道的功能［11］。除了一些細胞因子可與鈣通道結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能以外，Cav1.2鈣通道的遠C末端（DCRD 2 062～2 115）可與近C末端（PCRD 1 675～1 746）結(jié)合［12］，此結(jié)合作用在維持心臟正常功能方面具有重要作用，CT1片段即包括近C末端片段。因此，CT1片段是L型鈣通道重要的功能部位，其在維持鈣通道功能方面以及某些疾病中均具有關(guān)鍵作用。

基因重組技術(shù)是獲得大量目標蛋白的有效方法。重組蛋白在大腸桿菌中大量表達后可通過多種方法進行分離純化，例如液氮反復凍融法、超聲破碎法［13，14］等。液氮反復凍融法耗時長，超聲破碎法是刺耳的機械方法。本研究采用簡單易用的非離子去垢劑來裂解細胞和溶解蛋白，純化GST標簽的CT1融合蛋白。同時，采用體外pull?down assay和Western blot的方法對所制備純化的蛋白進行活性鑒定，為今后研究L型鈣通道片段CT1的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

原核表達載體pGEX?6p?3/CT1和BL21菌株由本實驗室保存。異丙基硫代?β?D半乳糖苷（IPTG）購自 Sigma公司，抗 Cav1.2（1507?1733）抗體購自StressMarq Biosciences公司，B?per購自 Thermo Sci?entic公司，Glutathione?Sepharose 4B beads，PreScis?sion Protease購自GE Healthcare公司。

1.2 pGEX?6p?3/CT1重組質(zhì)粒的誘導表達

將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX?6p?3/CT1轉(zhuǎn)化到E.coli BL?21中，經(jīng)過藍白篩選，將陽性克隆接種到含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩過夜，再將菌液稀釋，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6～1，再加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃震蕩誘導表達4 h，離心收集菌液，準備提取融合蛋白。

1.3 CT1的提取與純化

將收集的菌液加入B?per試劑（0.005 L/L菌液），同時加入蛋白酶抑制劑，DNA酶以及溶菌酶后，室溫孵育15 min，再向菌液中加入1.5%N?lauroylsarco?sine sodium salt室溫孵育15 min以促進CT1蛋白的溶解，12 000 r/min離心20 min，每0.015 L上清與0.2×10-3L GS?4B beads室溫孵育1 h，600 r/min，離心10 min，棄上清，加入PBS，洗3次，向管中加入Tris緩沖液（50 mmol/L Tris pH 8.0，150 mmol/L NaCl），4℃保存。Bradford蛋白濃度測定法測定融合蛋白的濃度。牛血清白蛋白作為標準品被用來做標準曲線。

1.4 CT1蛋白鑒定

取上面制備的GST?CT1融合蛋白0.02×10-3L，經(jīng)5×SDS loading buffer處理后，80 ℃煮10 min，上清進行12%SDS?PAGE電泳，根據(jù)蛋白marker檢測CT1蛋白。

1.5 pull?down assay鑒定蛋白活性

取連接于GS?4B beads的GST?CT1蛋白0.01×10-3L于0.002 LEP管中，加入CaM（終濃度分別為0，0.7，1.4，2.1，3.5，10 μmol/L，）、CaCl2（［Ca2+］2 mmol/L），細胞內(nèi)液緩沖液至0.2×10-3L，4 ℃，4 h。600 r/min，離心3 min，棄上清，同樣步驟清洗2遍。加入0.015×10-3L 5×SDS loading buffer洗脫處理，上清經(jīng)12%SDS?PAGE電泳，考馬斯亮藍染膠，應用CS analyzer 3.0軟件進行光密度測定。

1.6 Western blot鑒定CT1蛋白表達

將制備的CT1蛋白進行12%SDS?PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，anti?Cav1.2鈣通道抗體（抗C末端1 507～1 733氨基酸，StressMarq Biosciences公司，1/500）4℃孵育過夜，TBST洗膜15 min、3次后，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1/5 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜15 min、3次，ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1 pGEX?6p?3/CT1重組質(zhì)粒誘導表達及非離子型去污劑法純化CT1蛋白

pGEX?6p?3/CT1轉(zhuǎn)化入BL21后IPTG誘導表達，提取蛋白進行SDS?PAGE電泳后考馬斯亮藍染色觀察IPTG誘導前和誘導后蛋白表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPTG誘導表達后分子量54 kDa處出現(xiàn)1條明顯的特異性條帶（圖1A）。繼續(xù)采用實驗操作簡單的非離子去污劑法純化GST?CT1融合蛋白，此蛋白經(jīng)過SDS?PAGE電泳考馬斯亮藍染色后觀察，在分子量為54 kDa處存在GST?CT1融合蛋白條帶（圖1B）。

圖1 GST?CT1融合蛋白在BL21中表達及純化Fig.1 The expression and purification of the GST?CT1 fusion protein in BL?21

2.2 GST?CT1融合蛋白的Western blot鑒定

CT1蛋白片段是Cav1.2鈣通道位于1 509～1 789氨基酸的一段蛋白片段，我們采用anti?Cav1.2鈣通道的抗體對GST?CT1進行Western blot鑒定。本研究使用的抗體能識別1 507～1 733氨基酸部位，能夠檢測到心肌組織總蛋白中Cav1.2鈣通道蛋白（圖2A），因此能夠應用此抗體對CT1蛋白進行鑒定。結(jié)果顯示，在分子量為54 kDa處檢測到一條特異性條帶（圖2B），說明表達了GST?CT1融合蛋白，并且非離子去污劑B?per能夠成功制備GST?CT1融合蛋白。

2.3 GST?CT1與CaM濃度依賴性結(jié)合以鑒定CT1的生物學功能

圖2 Western blot鑒定鈣通道蛋白Fig.2 Western blot analysis of calcium channel protein

本實驗采用pull?down assay的方法對制備的GST?CT1融合蛋白與CaM的結(jié)合情況進行研究，結(jié)果表明，在鈣離子濃度為2 mmol/L時，CaM濃度依賴性的與GST?CT1融合蛋白中的CT1結(jié)合，見圖3。

圖3 CaM濃度依賴性與GST?CT1結(jié)合情況Fig.3 CaM bind to GST?CT1 fusion protein in a concentration?dependent manner

3 討論

CT1片段是L型鈣通道重要的功能片段，在許多生理和病理過程中起到關(guān)鍵作用。研究表明，許多細胞內(nèi)因子對L型鈣通道功能的調(diào)節(jié)是通過與鈣通道C末端相互作用而實現(xiàn)的，可能L型鈣通道C末端是鈣通道最重要的功能調(diào)節(jié)區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)，CaM、鈣調(diào)蛋白抑素（calpastatin）、CaMKⅡ都可與鈣通道C末端的近端相互作用，進而對鈣通道進行調(diào)節(jié)［15～17］，CT1蛋白片段即為L型鈣通道C末端的近端。本研究采用非離子去污劑B?per制備和純化鈣通道C末端1 509～1 789部位的蛋白片段（CT1片段），對此蛋白片段進行了Western blot鑒定。同時，采用pull?down assay的方法對CT1片段進行了生物學功能的檢測，結(jié)果顯示，非離子去污劑B?per方法純化制備的GST?CT1蛋白具有其本身的生物學功能，能夠應用于其他實驗進行相關(guān)研究，更進一步證實了本研究所制備的蛋白為具有生物學功能的GST?CT1融合蛋白。

目前，關(guān)于融合蛋白分離純化的方法很多，每種方法都有其優(yōu)點與缺點，本研究采用溫和非離子去污劑B?per方法對GST?CT1融合蛋白進行分離純化，與液氮反復凍融法和超聲破碎法比較，此方法具有技術(shù)簡單、操作快速等優(yōu)點，除此之外，B?per方法制備蛋白還具有其他一些優(yōu)點，例如某些蛋白誘導表達的過程中可能會產(chǎn)生一些包涵體，這會影響目標蛋白的提取，B?per方法在應用促溶劑的情況下，可成功抽提細菌裂解液中的包涵體蛋白；在使用B?per方法制備蛋白的過程中，蛋白始終保持濃縮，特別適用于小體積蛋白的抽提；B?per方法制備蛋白只需要使用B?per試劑就可使細胞裂解完全，不需要其他儀器；B?per方法制備蛋白使用Tris緩沖體系，對后續(xù)的相關(guān)蛋白研究提供了方便。但是，此方法在成本投入方面可能相對較高。因此，實驗研究中要根據(jù)具體的情況選擇合適的方法進行蛋白分離純化。

本研究成功誘導表達GST?CT1蛋白，并采用簡單、快速的B?per處理方法對GST?CT1融合蛋白進行分離純化，同時，對GST?CT1融合蛋白進行了鑒定和功能檢測。本研究不僅提供了融合蛋白制備的好方法，也為深入研究CT1片段與某些蛋白質(zhì)的相互作用及其生物學意義奠定了堅實的基礎，同時，也為闡明L型鈣通道相關(guān)調(diào)節(jié)機制以及明確某些相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供新的研究思路。

［1］Berridge MJ.Elementary and global aspects of calcium signalling［J］.J Physiol，1997，499（Pt 2）：291-306.

［2］Bers DM.Altered cardiac myocyte Ca regulation in heart failure［J］.Physiology，2006，21（6）：380-387.

［3］Song LS，Pi YQ，Kim SJ，et al.Paradoxical cellular Ca2+signaling in severe but compensated canine left ventricular hypertrophy［J］.Circ Res，2005，97（5）：457-464.

［4］Wang SQ，Stern MD，Ríos E，et al.The quantal nature of Ca2+sparks and in situ operation of the ryanodine receptor array in cardiac cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（11）：3979-3984.

［5］Asmara H，Minobe E，Saud ZA，et al.Interactions of calmodulin with the multiple binding sites of Cav1.2 Ca2+channels［J］.J Phar?macol Sci，2010，112（4）：397-404.

［6］Zhou H，Yu K，McCoy KL，et al.Molecular mechanism for divergent regulation of Cav1.2 Ca2+channels by calmodulin and Ca2+?binding protein?1［J］.J Biol Chem，2005，280（33）29612-29619.

［7］Xiong LW，Kleerekoper QK，He R，et al.Sites on calmodulin that in?teract with the C?terminal tail of CaV1.2 channel［J］.J Biol Chem，2005，280（8）：7070-7079.

［8］Xu JJ，Hao LY，Kameyama A，et al.Calmodulin reverses rundown of L?type Ca2+channels in guinea pig ventricular myocytes［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287：C1717-C1724.

［9］Pitt GS.Calmodulin and CaMKⅡ as molecular switches for cardiac ion channels［J］.Cardiovasc Res，2007，73（4）：641-647.

［10］Hao LY，Wang WY，Minobe E，et al.The distinct roles of calmodu?lin and calmodulin kinaseⅡin the reversal of run?down of L?Type Ca2+channels in Guinea?pig ventricular myocytes［J］.J Pharmacol Sci，2009，111（4），416-425.

［11］Lee TS，Karl R，Moosmang S，et al.Calmodulin kinaseⅡis in?volved in voltage?dependent facilitation of the L?type Cav1.2 calci?um channel：Identification of the phosphorylation sites［J］.J Biol Chem，2006，281（35）：25560-25567.

［12］Joanne TH，Vladimir YY，Lin TC，et al.Autoinhibitory control of the CaV1.2 channel by its proteolytically processed distal C?termi?nal domain［J］.J Physiol，2006，576（1）：87-102.

［13］王利利，劉彩紅，朱亞.高GChTwist融合蛋白載體構(gòu)建及其表達條件優(yōu)化［J］.中國醫(yī)科大學學報，2012，41（3）：204-207.

［14］邵陽光，劉姣，李豐.GST?HDAC4融合蛋白載體的構(gòu)建及其蛋白表達［J］.中國醫(yī)科大學學報，2013，42（2）：149-151.

［15］Han DY，Minobe E，Wang WY，et al.Calmodulin?and Ca2+?depen?dent facilitation and inactivation of the CaV1.2 Ca2+channels in Guinea?pig ventricular myocytes［J］.J Pharmacol Sci，2010，112（3）：310-319.

［16］Minobe E，Asmara H，Saud ZA，et al.Calpastatin domain L is a partial agonist of the calmodulin?binding site for channel activa?tion in Cav1.2 Ca2+channels［J］.J Biolo Chem，2011，286（45）：39013-39022.

［17］Hao LY，Xu JJ，Minobe E，et al.Calmodulin kinaseⅡactivation is required for the maintenance of basal activity of L?Type Ca2+chan?nels in Guinea ?pig ventricular myocytes［J］.J Pharmacol Sci，2008，108（3），290-300.