陳晉廣 ，賴維 ，姜昱

（1.廣東省中山市人民醫(yī)院，中山528403；2.浙江省臺州市立醫(yī)院，臺州318000；3.中山大學附屬第三醫(yī)院，廣州510630）

銀屑病是一種治療困難、危害大、復發(fā)率高的頑固性皮膚病。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，天然免疫而不是獲得性免疫在銀屑病的發(fā)病機制中起到更為重要的作用，天然免疫是機體免疫防御的首要防線,可能比特異性免疫紊亂對銀屑病的發(fā)病具有更關(guān)鍵的作用。目前調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell,Treg）在天然免疫紊亂中的作用成為研究的一大熱點。介導免疫耐受的Treg和介導炎癥反應的Th17細胞均來源于初始T淋巴細胞，兩者的分化過程和功能相互拮抗維持動態(tài)的平衡,從而維持機體的免疫穩(wěn)定。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細胞17（T helper 17 Cells,Th17）相關(guān)細胞因子人白細胞介素-17（human interleukin-17）、IL-23在銀屑病患者外周血中表達明顯高于正常人群，提示Th17功能失常參與了銀屑病發(fā)病過程[1]；本研究基于前期研究，對患者外周血Th17、Treg細胞的表達進行檢測，探討Th17/Treg的平衡偏移以及在其發(fā)病中的作用，結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 46例尋常性銀屑病患者來自2012年1月—2012年10月本院皮膚科門診和住院患者。其中靜止期21例（男12例,女9例；年齡19～51歲，病程 8～10.5年），進行期 25例（男13例，女12例；年齡18～50歲，病程8.5～11年）。銀屑病患者病情嚴重程度按照PASI[2]積分法評分并記錄。20例正常對照組來自本院門診獻血員（男11例，女9例；年齡18.5～48歲）。2組患者年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義。所有研究對象對實驗知情同意，實驗經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 排除標準 患者近半個月內(nèi)接受過免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素及光療等相關(guān)治療；伴有心腦血管、肝、腎等疾病及免疫性疾病和內(nèi)分泌等系統(tǒng)性疾病的患者。

1.3 Th17細胞和CD4+CD25+Treg細胞亞群檢測所有研究對象于清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，肝素進行抗凝，采用淋巴細胞分離液以聚蔗糖（ficoll）密度梯度法分離出外周血淋巴細胞,磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS；含 1%小牛血清）沖洗,制備淋巴細胞懸液（濃度1×109/L）。取淋巴細胞懸液置于 48孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔 1 mL,加 50 μg/L佛波酯、1 mg/L離子霉素和莫能菌素2 μmol/L,孵箱（德國 HERAEUS公司，37℃、5%CO2） 中培養(yǎng) 5 h。收集細胞分為實驗管和對照管，加入20 μL PE-Cy5標記的鼠抗人CD4單抗 （美國e Bioscience公司）混勻,放置20 min（室溫、避光），對細胞表面抗原進行染色。加200 μL Cytofix/Cytoperm液,在4℃下放置20 min，通透和固定細胞，洗滌。實驗管分別加入10 μL FITC標記的鼠抗人 CD25抗體（美國 e Bioscience公司）、FITC標記的IL-17抗體（美國e Bioscience公司），對照管加入同型對照抗體,孵育30 min后（4℃、避光）,用 Perm/Wash液1 mL洗滌 2次，以300 μL洗滌液重懸細胞，采用流式細胞儀（EPICS-XL COULTER）于24 h內(nèi)檢測分析。以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th細胞（CD4＋），最終以散點圖IL-17、CD25染色陽性分別表示 Th17細胞和 Treg細胞，數(shù)據(jù)用Cellsquest軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包分析。Th17與Treg細胞數(shù)量比較用Mann-Whitney檢驗；用Spearman建立Th17/Treg與PASI之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病患者Th17/Treg表達與對照組的比較進行期、靜止期銀屑病患者外周血中Th17細胞表達均明顯高于對照組（P<0.05），進行期表達水平高于靜止期患者（P<0.05）；2組患者Treg細胞表達與正常組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。進行期Th17/Treg明顯高于對照組和靜止期（P<0.05），靜止期患者 Th17/Treg高于對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 Th17、Treg表達患者PASI相關(guān)性分析 銀屑病患者外周血中Th17的表達與PASI呈正相關(guān)（rs＝0.421，P＜0.05）；Th17/Treg 與 PASI 呈正相關(guān)（rs＝0.502，P＜0.05）；Treg 與 PASI無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

表1 銀屑病患者Th17、Treg表達與對照組的比較

3 討論

在不同的條件和抗原刺激的信號中，初始CD4+T淋巴細胞可分化成多種亞型的T淋巴細胞，包括Th1/Th2型、Th17/Treg型，發(fā)揮相應的生物學效應[3]。其中，Th17/Treg細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的CD4+T新亞型，具有與Th1/Th2不同的獨立分化途徑，成為目前免疫學研究的熱點之一。Th17細胞在中性粒細胞的動員、募集、活化和介導促炎反應中起到重要的作用；Treg細胞在功能上和分化過程中與Th17細胞相互對抗，對機體自身反應性T細胞以及一些效應性T細胞活化具有選擇性抑制效應；正常生理狀態(tài)下兩者保持動態(tài)平衡。近年來隨著對Th17、Treg細胞研究的深入，使人們對許多自身免疫性疾病發(fā)病機制有了新的認識。越來越多證據(jù)表明，兩者在多種自身免疫性疾病、炎性疾病、腫瘤和感染性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。在銀屑病小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg細胞功能受損及IL-23/Th17途徑細胞因子水平增高[4]，提示Th17/Treg參與了銀屑病的發(fā)病過程。

本研究顯示，Th17細胞在銀屑病患者外周血中表達水平明顯升高。Chan等[5]在小鼠皮內(nèi)分別注射IL-23、Th1分化的關(guān)鍵細胞因子IL-12，經(jīng)注射IL-23后誘導產(chǎn)生的炎癥性病理表現(xiàn)與銀屑病皮損更為接近，研究認為Th17細胞可能是產(chǎn)生銀屑病皮損病變的主要啟動者。筆者本次研究還發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者外周血中Treg細胞與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。由此推測，Th17細胞呈表達狀態(tài)，而患者Treg不能伴隨Th17細胞升高而上升，勢必導致患者Th17/Treg比值的升高。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損處Th17/Treg比例與PASI積分呈負相關(guān)，而循環(huán)中Th17/Treg的比例與PASI分數(shù)呈正相關(guān)。筆者本次研究顯示，銀屑病患者外周血中Th17的表達與 PASI呈正相關(guān)，Th17/Treg與PASI呈正相關(guān)，與Zhang等[6]報道一致。提示，銀屑病Th17/Treg變化水平可能為今后臨床評估患者病情提供又一客觀指標。近年來隨著Th17/Treg研究深入，開展了許多針對性治療的實驗研究?？鼓[瘤壞死因子拮抗劑依那西普能夠逆轉(zhuǎn)Th1/Th17細胞的活化，從而上調(diào)Th2、Treg亞群，達到治療銀屑病的目的[7]；臨床研究發(fā)現(xiàn)，糾正銀屑病患者Th17/Treg的失衡有望成為新的藥物治療靶點[8]。因此，通過Th17/Treg失衡的研究不僅解釋或完善銀屑病部分發(fā)病機制，而且可能在臨床上為銀屑病臨床治療提供新方向。

[1]陳晉廣，楊志波.“血分論治”治療尋常性銀屑病患者外周血白介素17和白介素23的變化 [J].中華皮膚科雜志,2012,45（2）:67-68.

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[6]Zhang L,Yang XQ,Cheng J,et al.Increased Th17 cells are accompanied by FoxP3（＋）Treg cell accumulation and correlated with psoriasis disease severity[J].Clin Immunol,2010,135:108-117.

[7]Quaglino P,Bergallo M,Ponti R,et al.Th1,Th2,Th17 and regulatory T cell pattern in psoriatic patients:modulation of cytokines and gene targets induced by etanercept treatment and correlation with clinical response[J].Dermatology,2011,223:57-67.

[8]陳晉廣，賴維，姜昱.“血分論治”對尋常型銀屑病患者Th17/Treg影響的研究[J].中國醫(yī)師雜志,2012,14（8）:1027-1028.