張英展 周應畢 劉斌

隨著人們生活水平的不斷提高，心血管疾病發(fā)病率迅速升高[1]。其中，高血壓病已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一。血管內(nèi)皮的舒張功能異常會增加外周血管阻力，在高血壓的發(fā)病過程中血管內(nèi)皮的舒縮功能異常起到重要作用。普遍認為，血管及其內(nèi)皮所產(chǎn)生的一系列生化因子維持和調(diào)節(jié)著血管舒張或收縮反應[2]。等長收縮法離體張力實驗能很好地反映血管的伸縮效應[3]。目前，各種小鼠疾病模型和基因敲除小鼠廣泛應用于心血管疾病研究，但現(xiàn)階段離體張力實驗普遍用于檢測大管徑血管，國內(nèi)對檢測小鼠小管徑阻力血管少見報道[4-5]。因此，本實驗將建立一種用等長收縮法測定小鼠腸系膜動脈血管舒縮效應的方法，為檢測小鼠腸系膜動脈張力變化提供直觀、可靠的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF級C57BL/6成年雄性小鼠（南京大學模式動物研究所，中國）；試劑：花生四烯酸鈉鹽（AA）、N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（L-NAME）、苯腎上腺素（PE）、乙酰膽堿（ACh），上述試劑均來自美國sigma公司；重要溶液的配制：生理鹽溶液（PSS）：其成分為123 mmol/L氯化鈉，4.7 mmol/L氯化鉀，15.5 mmol/L碳酸氫鈉，1.2 mmol/L磷酸二氫鉀，1.2 mmol/L硫酸鎂，1.25 mmol/L氯化鈣，以及11.5 mmol/L葡萄糖；含60 mmol/L氯化鉀的PSS（K+-PSS）：含67.7 mmol/L氯化鈉，60 mmol/L氯化鉀，其他成分同PSS。儀器：壓力傳感器（AE801，Kronex公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 血管環(huán)的制備 取C57BL/6小鼠腸系膜動脈并置于生理鹽溶液（PSS）中，剝離血管周圍脂肪和結締組織，并將動脈橫切成1.0 mm長的血管環(huán)。

1.2.2 靜息血管環(huán)張力校正 在體視顯微鏡下，于裝有PSS的37 ℃恒溫水浴槽內(nèi)，將血管環(huán)安裝在兩根直徑為50 μm的鎢絲間。其中一根鎢絲固定，而另一根與微力傳感器相連，數(shù)據(jù)經(jīng)橋式放大器后連入PowerLab進行采集和處理。血管環(huán)的前負荷通過遞增法調(diào)至最適水平（1.0 mm小鼠腸系膜動脈環(huán)約250 mg）。實驗時血管環(huán)先用60 mmol/L的K+-PSS溶液預收縮，每隔15 min 1次，直至其對K+-PSS的反應達到最佳且可重復。

1.2.3 血管環(huán)張力監(jiān)測 在有或無一氧化氮合酶（NOS）抑制劑（L-NAME）的情況下，加入苯腎上腺素（PE）預收縮，平衡10 min后，使血管張力達到最高值，再加入相應的刺激物，實時記錄血管環(huán)張力結果。其舒張強度以降低苯腎上腺素誘發(fā)收縮的百分比來表示。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用PEMS 3.1統(tǒng)計學軟件進行分析，計數(shù)資料使用字2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 檢測乙酰膽堿對血管環(huán)的舒張效應 按上述試驗方法，在30 μmol/L苯腎上腺素預收縮的基礎上，分別加入0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 μmol/L的乙酰膽堿，結果如圖1所示，可見乙酰膽堿能很好地誘導小鼠腸系膜動脈血管環(huán)的血管舒張效應，該效應隨濃度的增加而增大，并且在加入乙酰膽堿濃度為0.03～0.3 mol/L時舒張變化幅度最大。

圖1 乙酰膽堿對小鼠腸系膜動脈舒張作用成濃度依賴性變化

2.2 檢測花生四烯酸對血管環(huán)非NO依賴性的舒張效應 分別加入3、10 mol/L花生四烯酸檢測小鼠腸系膜動脈血管環(huán)的舒張程度。結果如圖2所示：加入3 mol/L花生四烯酸誘導小鼠腸系膜動脈血管環(huán)產(chǎn)生舒張效應，約為23%；而加入10 mol/L花生四烯酸所誘導的舒張效應約為64%。兩種濃度的花生四烯酸對小鼠腸系膜動脈的舒張作用比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并使用SPSS統(tǒng)計軟件處理（結果為3次獨立實驗完成）。

圖2 不同濃度花生四烯酸對小鼠腸系膜動脈的舒張作用

3 討論

一般認為，血管及其內(nèi)皮釋放的各種生化物質(zhì)在血管的舒縮功能中扮演著重要的角色，參與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此，建立一種能較好地檢測小管徑阻力血管功能的實驗方法對進一步研究具有重要意義。

目前國內(nèi)在離體張力實驗研究中，血管環(huán)多數(shù)采用管徑較大的血管（如大鼠主動脈或小鼠主動脈等），血管環(huán)橫切長度多為3.0～4.0 mm。而對更加短小的小鼠阻力血管（如腸系膜動脈等）鮮見報道。在本實驗中，筆者采用的直徑較小的鎢絲（50 μm）和更加靈敏的微力傳感器（AE801），可檢測到直徑為100～200 μm、橫切長度為1.0 mm血管環(huán)，保證了細小血管內(nèi)皮的完整、并克服了其長度不夠的不足，從而充分滿足以腸系膜動脈為代表的小鼠阻力血管舒縮反應檢測的需要。在實驗過程亦發(fā)現(xiàn)，血管剝離程度及速度直接影響實驗結果，應快速剝離干凈血管，以避免血管內(nèi)皮活性分子的活性減弱或喪失。

為了清晰地闡明小鼠腸系膜動脈功能性參與，在不抑制NOS的情況下，直接加入血管內(nèi)皮受體激動劑ACh后，結果引起血管環(huán)舒張效應，并且該效應隨ACh濃度增加而增大，導致該舒張效應可能是通過血管內(nèi)皮依賴性NO、內(nèi)皮超極化因子（EDHF）和內(nèi)皮環(huán)氧化酶（COX）產(chǎn)物PGI2共同作用的結果，但起主要作用可能是內(nèi)皮依賴性NO的釋放，同時該實驗也提示血管環(huán)的內(nèi)皮及平滑肌在操作過程中保持著完好的生理活性。雖然NO通過血管內(nèi)皮發(fā)揮舒張血管作用，但是非NO依賴性物質(zhì)亦在血管中亦發(fā)揮著重要作用。為此，通過L-NAME作用排除NO對實驗結果的影響的情況下，加入AA后，血管環(huán)產(chǎn)生非NO依賴性舒張效應，提示AA可能通過其代謝產(chǎn)物誘導產(chǎn)生舒張效應。

綜上所述，通過兩種不同類型的刺激物都誘導小鼠腸系膜動脈血管環(huán)的舒張效應，表明該實驗方法檢測以腸系膜動脈為代表的小鼠阻力血管的舒縮反應是完全可行的，從而為以小鼠為模型的心血管疾病研究中檢測阻力血管舒縮反應提供直觀、可靠的實驗方法。

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