王冬梅，呂振江，王永紅，張春孫

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.上海睿智化學(xué)研究有限公司，上海 201203）

玉竹Ploygonatum odoratum為百合科Liliaceae黃精屬Ploygonatum多年生草本植物，以干燥根莖入藥［1－2］。玉竹是中國的傳統(tǒng)中草藥，且可藥食兩用。該藥性甘，微寒，能養(yǎng)陰潤肺，益胃生津，用于燥熱、傷陰、熱傷胃陰之癥［3－4］。藥理研究表明，玉竹能增強(qiáng)免疫力，煎劑有擴(kuò)張血管、抗急性心肌缺血、降壓、抗衰老、抗菌作用，注射液有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用［5－6］。玉竹的藥理作用與其多種活性成分有密切關(guān)系。糖類是玉竹的主要成分，其次是黃酮類化合物和甾體皂苷［7－9］。目前，國內(nèi)外對(duì)玉竹的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、臨床療效等方面，而對(duì)玉竹的炮制方法、炮制工藝及飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鮮有研究。玉竹為傳統(tǒng)中藥，臨床需炮制后方可入藥［10］。玉竹干條、干片（飲片）也是玉竹進(jìn)入藥材市場的主要方式［11］?！吨腥A人民共和國藥典》所頒布的玉竹炮制規(guī)范中僅涉及其除雜、水洗，潤透，切厚片或段，干燥等工藝，而且對(duì)具體的工藝參數(shù)沒有規(guī)范，另外，目前對(duì)玉竹生品加工的研究主要是關(guān)于藥材干燥方法和去皮、切片等處理［12－14］。由于不同操作的人有不同的經(jīng)驗(yàn)，所得產(chǎn)品很難一致，甚至存在誤傳誤用，嚴(yán)重影響了中藥的療效。陳勝璜等［15］研究表明，玉竹的炮制方法主要有蒸法（清蒸、酒蒸、和蜜蒸）和炒法（清炒、蜜炒）2類，蒸法優(yōu)于炒法，但卻未說明具體的蒸制影響因素。作者在前期研究中已對(duì)玉竹蜜蒸炮制工藝進(jìn)行了研究，確定了玉竹蜜蒸炮制的最優(yōu)條件，但卻沒有對(duì)玉竹酒蒸工藝進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究和比較，因此，為了進(jìn)一步確定玉竹炮制的最佳方法和工藝條件，本研究以多糖、皂苷、黃酮、醇提物、水溶物和水分等6個(gè)指標(biāo)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以6種成分的抗氧化活性和含量為基礎(chǔ)，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法及正交試驗(yàn)優(yōu)化了玉竹的酒蒸炮制工藝，以期為改善玉竹炮制品的質(zhì)量，提升玉竹在藥用或保健食品等方面的應(yīng)用價(jià)值提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 玉竹根莖于2010年10月采自秦嶺太白山厚畛子。樣品由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院李登武教授鑒定，切成薄片，自然干燥后備用。

1.1.2 儀器與試劑 TU1810型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；JA5003型分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；R-GG17型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；SHB-Ⅱ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；HHSY2-N18型電熱恒溫水浴鍋（哈爾濱東聯(lián)公司）。無水葡萄糖（廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)20100508），薯蕷皂苷元（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)111539-20000），蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號(hào)100080-200707），黃酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)為 14.5%，總糖以葡萄糖計(jì)≤15.0 g·L－1）。苯酚、濃硫酸、高氯酸、甲醇、無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、三氯化鋁均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 玉竹酒蒸工藝中有4個(gè)關(guān)鍵因素：酒潤時(shí)間、黃酒用量、蒸制時(shí)間和蒸制溫度。每個(gè)因素根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)選定5個(gè)水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再選定3個(gè)因素和3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（表1）。

表1 試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of factor experiential

1.2.2 樣品的炮制 稱取玉竹藥材60.00 g，置于適宜容器內(nèi)，依據(jù)表1設(shè)計(jì)的炮制條件進(jìn)行炮制。先用定量的黃酒（A）拌勻，悶潤（D）至黃酒被吸盡后，再按蒸制時(shí)間（B）和蒸制溫度（C）進(jìn)行炮制。60℃干燥4 d后，測定炮制品中各指標(biāo)（表2）。

表2 指標(biāo)權(quán)重Table 2 Weight of index

1.2.3 多糖測定［16－17］①標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品60.0 mg，用蒸餾水溶解定容至100.0 mL。分別精密吸取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL上述標(biāo)準(zhǔn)液并定容至 50.0 mL。分別吸取2.0 mL上述溶液置試管中，加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)為5%苯酚，7.0 mL濃硫酸，搖勻，靜置5 min，沸水浴加熱15 min，置冰水浴5 min。另吸取2.0 mL蒸餾水重復(fù)上述操作，做空白對(duì)照。在波長490 nm處測吸光度。以質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝5.733 33x+0.032 4（r＝0.999 6，線性范圍0.024～0.120 mg）。②樣品中多糖測定。稱取玉竹樣品2.00 g，加水200.0 mL，浸泡12.0 h，80℃回流1.5 h，提取1次，合并濾液，濃縮至5.0 mL，加無水乙醇至醇體積分?jǐn)?shù)為95%，加入1.0 mol·L－1氫氧化鈉，調(diào)節(jié)酸堿度至pH 7，靜置12.0 h，過濾，將濾渣于60℃下鼓風(fēng)烘干即得多糖精制品。取多糖精制品25.0 mg，加水溶解并定容至50.0 mL，吸取3.0 mL加水定容至50.0 mL，得樣品溶液。吸取樣品溶液2.0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法操作，顯色，測定，計(jì)算多糖。

1.2.4 皂苷測定［18］①標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取3.0 mg薯蕷皂苷元，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，精密移取0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL上述溶液，用高氯酸定容至10.0 mL，旋渦混勻1 min后置70℃水浴中加熱15 min，立即置于冰水浴中5 min以停止反應(yīng)，以高氯酸為空白對(duì)照，在波長408 nm處測定吸光度。以質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝3.549 8x+0.077 0（r＝0.999 9，線性范圍0.060～0.240 mg）。②樣品中皂苷測定。稱取玉竹樣品 5.00 g，加60.0 mL石油醚脫脂2.0 h，加入45.0 mL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇浸泡12.0 h，80℃水浴中回流提取2次，1.5 h·次－1，合并濾液，濃縮至干。50.0 mL蒸餾水溶解，用正丁醇萃取3次，合并萃取液，濃縮至干即得皂苷粗品。用甲醇溶解皂苷粗品并定容至50.0 mL，取溶液0.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法操作，測吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中皂苷。

1.2.5 黃酮測定［19］①標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取4.00 mg蘆丁對(duì)照品，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶解并定容至100.0 mL容量瓶中，即得對(duì)照品溶液。分別移取1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL對(duì)照品溶液于 25.0 mL 容量瓶中，加入 1.0 mL 0.50 mol·L－1亞硝酸鈉（NaNO2），靜置 5 min 后加 1.0 mL 0.30 mol·L－1氯化鋁（AlCl3）溶液，搖勻，5 min后加入5.0 mL 1.0 mol·L－1氫氧化鈉溶液，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇定容至刻度，空白對(duì)照用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇代替對(duì)照品溶液，在525 nm波長處測吸光度。以質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝0.500 01x－0.003 4（r＝0.999 3，線性范圍0.040～0.400 mg）。②樣品中黃酮含量的測定。稱取玉竹樣品5.00 g，加60.0 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，浸泡1.0 h，在80℃水浴中回流提取2次，2.0 h·次－1，合并濾液，定容至250.0 mL。吸取溶液5.0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法操作，測吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中黃酮。

1.2.6 水分測定 將各酒蒸玉竹樣品冷卻至室溫后，精密稱取1.00 g，60℃下烘干至恒質(zhì)量后，計(jì)算水分含量。

1.2.7 水溶物測定 稱取酒蒸玉竹樣品2.00 g于錐形瓶中，加水50.0 mL，靜置1.0 h后，80℃水浴回流1.0 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，稱量，計(jì)算水溶物。

1.2.8 醇溶物測定度 稱取酒蒸玉竹樣品2.00 g于錐形瓶中，加50.0 mL無水乙醇，靜置1.0 h后，80℃水浴回流1.0 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，稱量，計(jì)算醇溶物。

1.2.9 層次分析法［20－21］①層次分析法的基本思路。通過將復(fù)雜問題分解為若干層次或若干要素，并在同一層次各要素之間簡單地進(jìn)行比較、判斷和計(jì)算，即可以得出不同方案的重要度，從而為選擇最佳方案提供決策依據(jù)。②權(quán)重系數(shù)的確定。根據(jù)層次分析法原理，以多糖、皂苷、黃酮、醇溶物、水溶物和水分6個(gè)指標(biāo)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以6種成分的抗氧化活性和含量為基礎(chǔ)［22－24］，反應(yīng)玉竹酒蒸工藝的總評(píng)價(jià)目標(biāo)，建立評(píng)價(jià)目標(biāo)樹，確定權(quán)重系數(shù)（表2）。經(jīng)一致性檢驗(yàn)，判別矩陣的一致性比例＜0.10，表明權(quán)重系數(shù)合理有效。

權(quán)重系數(shù)計(jì)算公式：

1.2.10 單因素試驗(yàn)［25］選取影響酒蒸工藝的幾個(gè)主要參數(shù)，酒潤時(shí)間、料液比、酒蒸時(shí)間、酒蒸溫度，分別討論各參數(shù)對(duì)各指標(biāo)的影響。試驗(yàn)因素和水平見表1。

1.2.11 工藝優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取料液比（A）、酒蒸時(shí)間（B）、酒蒸溫度（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平（表1）。以多糖、皂苷、黃酮、醇提物、水溶物和水分6個(gè)指標(biāo)為考察對(duì)象，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，利用層次分析法進(jìn)行多指標(biāo)評(píng)價(jià)一步優(yōu)選玉竹酒蒸工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表3及圖1可以看出：4個(gè)因素對(duì)各指標(biāo)的綜合得分均在第2水平達(dá)到最大值。即綜合得分在酒潤時(shí)間為2.0 h，料液比為100∶20、溫度為70℃及蒸煮時(shí)間為2.0 h時(shí)分別達(dá)到最高。圖1還顯示：酒潤時(shí)間各水平的綜合得分變化較平緩，說明該因素對(duì)各指標(biāo)的影響較小。所以在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中不再考慮該因素。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Result of single factor experiment

2.2 工藝優(yōu)選試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取料液比（A），酒蒸時(shí)間（B），酒蒸溫度（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平（表1）。以多糖、皂苷、黃酮、醇提物、水溶物和水分6個(gè)指標(biāo)為考察對(duì)象，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，利用層次分析法進(jìn)行多指標(biāo)評(píng)價(jià)一步優(yōu)選玉竹酒蒸工藝［26－27］。

直觀分析結(jié)果（表4）表明：以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，在所選的因素水平范圍內(nèi)，料液比對(duì)玉竹各指標(biāo)的提取效果影響最大，酒蒸時(shí)間影響較小，酒蒸溫度影響最小。方差分析結(jié)果（表5）表明：料液比對(duì)綜合評(píng)分的影響均達(dá)到顯著水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037），酒蒸溫度、酒蒸時(shí)間影響不顯著。選取最佳酒蒸條件為A2B3C1；即料液比為100∶20，酒蒸溫度為60℃，酒蒸時(shí)間為3.0 h。

表3 單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of single factor experiment

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of L9（34）orthogonal test

各因素不同水平間多重比較結(jié)果顯示（表6），料液比的后2個(gè)水平差異不顯著，酒蒸溫度、酒蒸時(shí)間的3個(gè)水平之間差異不顯著，因此，從節(jié)約原料，經(jīng)濟(jì)價(jià)值，減少能耗等方面考慮，本研究最終選取的酒蒸條件為A2B1C1；即料液比為100∶20，酒蒸溫度為60℃，酒蒸時(shí)間為1.0 h。

表5 正交試驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：酒潤時(shí)間對(duì)玉竹各指標(biāo)綜合得分的影響最小，料液比、酒蒸時(shí)間、酒蒸溫度3個(gè)因素對(duì)各指標(biāo)綜合得分影響較大，且均在第二水平綜合得分最高。正交試驗(yàn)分析結(jié)果表明：料液比對(duì)各指標(biāo)綜合得分影響最顯著，酒蒸時(shí)間、酒蒸溫度兩因素均不顯著。綜合直觀分析、方差分析、多重比較、生產(chǎn)成本及周期，本研究最終選取的酒蒸條件為A2B1C1，即料液比為100∶20，酒蒸溫度60℃，酒蒸時(shí)間1.0 h。

中藥炮制和制藥、臨床應(yīng)用關(guān)系密切，大部分藥材需經(jīng)過炮制才能用于臨床和制劑的生產(chǎn)。藥物在炮制過程中，往往需要加入一些輔料與藥物一起共制，目的在于消除有害物質(zhì)，發(fā)揮有利作用。如酒、醋、鹽、姜、蜂蜜等，經(jīng)過添加不同的輔料炮制后起的作用各異。如酒蒸黃精可免去生用刺激咽喉的毒副作用［28－29］；酒蒸黃芩可阻止黃芩素酶解，利于保存藥效等［30］；酒蒸后的山萸肉補(bǔ)肝腎作用增強(qiáng)，常用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟等癥［31］。由于玉竹炮制前、后與藥效相關(guān)的關(guān)鍵化學(xué)成分尚未完全明確，因此，有關(guān)玉竹酒蒸后具體的藥效變化及炮制機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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